Rational drug design of novel potent multifunctional agents for Alzheimer’s disease treatment

Abstract

A demência é um importante problema de saúde pública e uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo. A doença de Alzheimer (DA) representa 60 a 70% dos casos de demência e os tratamentos farmacológicos atualmente disponíveis visam apenas controlar alguns sintomas e não oferecem qualquer cura plausível nem mesmo ação preventiva. Portanto, há uma necessidade urgente no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas eficazes contra a DA.A DA é uma doença neurodegenerativa extremamente grave e complexa, cuja origem parece resultar de uma combinação de múltiplos fatores. Entre as vias patológicas sugeridas, o péptido beta-amilóide (βA) desempenha um papel crucial na fisiopatologia da DA. A vasta evidência científica sobre o péptido βA encoraja o desenvolvimento racional de estratégias terapêuticas direcionadas ao βA para o tratamento da DA.A enzima BACE1 é necessária para a formação de todas as formas monoméricas de βA, que se agregam posteriormente em espécies conformacionais bioativas, como por exemplo, os oligómeros, que são indicados como as espécies neurotóxicas que contribuem para o desenvolvimento da DA. Por outro lado, a enzima glutaminil ciclase (QC) está envolvida na formação de piroglutamato-β-amilóide (pE-βA), uma das formas modificadas a nível pós-tradução mais conhecidas do peptídeo βA. A forma pE-βA agrega-se com maior propensão e origina espécies de oligómeros altamente tóxicas.Desta forma, interferir com a atividade enzimática da BACE1 ou QC é visto como um tipo de abordagem promissor para prevenir os mecanismos subjacentes à patogénese da DA.Esta tese assenta no uso integrado de métodos de descoberta de fármacos, nomeadamente o design de fármacos assistido por computador, ensaios in vitro e síntese química, de forma a identificar novas e potentes pequenas moléculas inibitórias de BACE1 ou da QC.Em relação à abordagem envolvendo a BACE1, foram desenvolvidas duas estratégias complementares de modelação de farmacóforo de forma a revelar características importantes para a ligação no local ativo da enzima. A estratégia baseada na estrutura considerou a informação estrutural do domínio catalítico da BACE1, e a abordagem baseada nos ligantes considerou a estrutura química de potentes inibidores conhecidos da BACE1. Após o screening virtual (SV) baseado nos farmacóforos em várias bases contendo moléculas drug-like, os compostos que cumpriram os requisitos farmacofóricos foram selecionados para docking molecular. Os compostos com maior score de docking foram posteriormente avaliados num ensaio in vitro para determinar a sua capacidade de inibir a BACE1. Treze novos scaffolds com atividade inibitória para a BACE1 foram identificados. Além disso, o melhor composto hit, o 3.11, demonstrou permear a barreira hematoencefálica num ensaio in vitro. Curiosamente, este composto também demonstrou ação inibitória contra a enzima QC.Em relação à abordagem relacionada com a QC, foram efetuados, primeiramente, estudos de modelação molecular de forma a prever as características de superfície molecular e dos locais de ligação da enzima QC e identificar os locais hotspot e, finalmente, criar os farmacóforos baseados na estrutura. Após o SV em duas bases de moléculas drug-like, os compostos que cumpriram os requisitos farmacofóricos foram selecionados para docking molecular. Os compostos com maior score de docking foram posteriormente avaliados num ensaio in vitro para determinar a sua capacidade de inibir a QC. Os resultados demonstraram que a maioria dos compostos testados diminuiu a atividade enzimática da QC e são estruturalmente distintos dos inibidores conhecidos. Os compostos hit 4.15 e 4.21 foram os mais ativos e foram usados como pontos de partida no design de duas bibliotecas virtuais de derivados de amida, que foram posteriormente submetidos a previsões de docking. As modificações estruturais incluíram a formação de amidas e a introdução de dois tipos de substituintes com grupos contendo azoto. Todos os derivados exibiram uma afinidade de ligação promissora para o domínio catalítico da QC. Por fim, cinco derivados foram sintetizados com sucesso e os seus efeitos inibitórios avaliados in vitro. Os novos derivados sintetizados, 5.1 e 5.2, foram os mais potentes (IC50 de 2.05 e 1.39 µM, respetivamente) e não demonstraram toxicidade significativa em estudos preliminares de viabilidade celular usando o ensaio MTT. Além disso, estes compostos demonstraram permear a barreira hematoencefálica num ensaio in vitro. Assim, os compostos 5.1 e 5.2 são promissores leads para o desenvolvimento estrutural de novos inibidores da QC.Posto isto, o conjunto destes resultados permitiu a identificação de novos e promissores scaffolds de inibidores da BACE1 e da QC. Além disso, considerando o inibidor 3.11, que tem capacidade de inibir a BACE1 e a QC, o trabalho desenvolvido nesta tese permite ainda sugerir novas linhas de investigação relacionadas com compostos com ação simultânea nestas duas enzimas.

Dementia is a major public health problem and, one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. Alzheimer’s disease (AD) represents 60 to 70% of dementia cases. Current available AD pharmacological treatments only aim to manage some clinical symptoms and do not offer any plausible cure nor prevent or delay the disease progression. Therefore, there is an urgent need for the development of effective therapeutic approaches against AD.AD is an extremely and complex serious neurodegenerative disease, which is attributed to a combination of multiple factors. Among the many pathological pathways, amyloid-β (Aβ) supports a crucial role in AD pathophysiological dynamics. The vast literature on the Aβ pathway shows evidence from basic research studies to human genetic and biomarker investigations, which encourages the rationale for the development of Aβ-targeting therapeutic strategies for the early treatment of AD.BACE1 enzyme is required for the generation of all monomeric forms of Aβ, which aggregates into bioactive conformational species, for instance, the Aβ oligomers which are likely to contribute to the neurotoxic events in AD. On the other hand, glutaminyl cyclase (QC) is involved in the formation of pyroglutamate-amyloid-β (pE-Aβ), one of the most known post-translational modified forms of Aβ peptide. pE-Aβ aggregates with greater propensity and forms highly toxic oligomer species.Targeting BACE1 and QC enzymes have emerged as promising approaches to prevent the mechanisms underlying AD pathogenesis.This thesis relies on integrated drug discovery methods including computer-aided drug design (CADD), in vitro assays, and chemical synthesis to discover new and potent small molecule inhibitors of BACE1 and QC.In the approach regarding the BACE1, a structure- and ligand-based pharmacophore strategy was first applied based on the information retrieved from structural data of the BACE1 catalytic domain and potent known BACE1 inhibitors, respectively, to disclose key features involved in BACE1 ligand-binding. After a pharmacophore-based virtual screening (VS) against several drug-like compound databases, the hits that simultaneously matched the structure- and ligand-based pharmacophore hypotheses were selected for molecular docking. The top-scoring compounds from the docking calculations were submitted to in vitro evaluation to determine their ability to inhibit BACE1. Thirteen novel BACE1 inhibitor scaffolds with interesting activity were identified. Furthermore, the best hit-compound 3.11 (IC50 of 15.4 µM) proved to permeate the blood-brain barrier (BBB) in an in vitro assay. Notably, this compound also exhibited inhibitory effects against QC (IC50 of 17.25 µM).In the approach concerning the QC, studies on the molecular surface and protein binding sites were firstly carried out to provide insights into the QC binding site, which contributed to the disclosure of important ligand-binding hotspots and ultimately for the pharmacophore modelling. After a pharmacophore-based VS against two drug-like compound databases, the hits that matched the pharmacophore hypotheses were selected for molecular docking. The top-scoring compounds from the docking calculations were submitted to an in vitro coupled-enzyme screening assay to determine their ability to inhibit QC. Results showed that most of the tested compounds decreased QC activity and are structurally distinct from known QC inhibitors. The hit-compounds 4.15 and 4.21 were the most active and were used as starting points in the design of two amide derivative libraries, which were further subjected to docking calculations against QC. Structural modifications included the formation of amide bonds and the introduction of two types of substituents with nitrogen-containing groups. All derivatives exhibited a promising binding affinity for the ligand-binding domain of QC. Five amide derivatives were synthesised and in vitro evaluated by the QC coupled-enzyme assay. The newly synthesised derivatives, 5.1 and 5.2, were the most potent (IC50 of 2.05 and 1.39 µM, respectively) and showed no significant toxicity in preliminary studies of cell viability using the MTT assay. In addition, both compounds are BBB permeable in an in vitro assay. Thus, compounds 5.1 and 5.2 are promising leads for the development of novel QC inhibitors.Taken together, these results provided the identification of novel and promising BACE1 and QC inhibitor scaffolds. Also, considering the dual effect of compound 3.11 for these two enzymes, new directions for the investigation of unexplored scaffolds acting simultaneously on BACE1 and QC were opened through the work developed in this thesis.