Stargazin as a regulator of neuronal excitability

Abstract

A excitabilidade neuronal é uma propriedade fundamental dos neurónios, que lhes confere a capacidade de gerarem impulsos eléctricos em resposta a estímulos, e que está na base da comunicação neuronal. A corrente-M é um tipo de corrente de potássio de limiar baixo que controla a excitabilidade dos neurónios, contribuindo para a diminuição do disparo consecutivo de potenciais de ação. Os canais M associam-se em tetrâmeros que podem ser homo ou heteroméricos e são alvo de várias formas de neuromodulação. Mutações no gene KCNQ2, que codifica a subunidade Kv7.2 deste canais, são responsáveis por várias formas de epilepsia e doenças do neurodesenvolvimento. Apesar das correntes-M serem críticas na regulação da excitabilidade e a sua disfunção ser causa de epilepsia, são ainda pouco conhecidas formas de regulação destas correntes. Neste trabalho identificou-se um novo interactor da subunidade Kv7.2, a proteína stargazina, uma proteína já caracterizada como proteína auxiliar os receptores de glutamato do tipo AMPA. Neste trabalho, foi caracterizada a nova interação entre stargazina e Kv7.2 e foi testado o seu impacto na modulação da excitabilidade neuronal.Através de ensaios de co-immunoprecipitação e de ligação de proximidade verificámos que a stargazina interage com canais Kv7.2 em neurónios. A co-expressão de stargazina com Kv7.2 aumentou a expressão do canal à superfície da célula e potenciou as correntes mediadas por Kv7.2, sem causar alterações na resposta dependente de voltagem. Quando a expressão de stargazina foi silenciada em neurónios, ensaios eletrofisiológicos revelaram diminuição das correntes-M, e ensaios de microscopia de super-resolução evidenciaram alterações da nano-organização do canais-M-Kv7.2. O impacto de uma mutação na stargazina associada a défice intelectual na regulação de canais-M-Kv7.2 foi também avaliado. Esta variante da stargazina não potenciou as correntes mediadas pelos canais de Kv7.2, e os neurónios do subículo de um modelo murganho knock-in para esta forma mutada da stargazina apresentam as correntes-M diminuídas e baixa hiperpolarização do potencial de membrana após indução de disparos consecutivos. Estes animais apresentaram também uma maior susceptibilidade à indução de convulsões com pentilenetetrazol.Conjuntamente com a diminuição de disparos consecutivos, as correntes-M regulam a plasticidade estrutural do segmento inicial do axónio (AIS), um compartimento neuronal onde há um enriquecimento em canais iónicos sensíveis a voltagem que estão na génese de potenciais de ação. A morfologia do AIS e a sua plasticidade têm um papel muito importante na regulação da excitabilidade neuronal. Verificámos que ao silenciar a stargazina em neurónios, estes apresentaram um AIS mais longo e com uma posição mais distal em relação ao soma. Já os neurónios de murganhos knock-in para a mutação de stargazina apresentaram também um AIS mais longo, mas localizado mais próximo do soma. Os neurónios onde a stargazina foi silenciada não apresentaram plasticidade homeostática do AIS em resposta a atividade neuronal prolongada. Assim, a stargazina revela-se uma proteína importante para os mecanismos de plasticidade do AIS.Este trabalho apresenta um conjunto de dados que sugerem uma nova função da stargazina no controlo da excitabilidade neuronal por duas vias, através da modulação dos canais-M-Kv7.2 e através a regulação da plasticidade do AIS. Esta nova função da stargazina pode estar alterada em doenças do neurodesenvolvimento com origem genética.

Neuronal excitability refers to the ability of neurons to generate a change in membrane voltage in response to stimuli, and it is a fundamental characteristic of neurons at the basis of neuronal communication. The M-current is a low-threshold potassium current that determines neuronal excitability and contributes to dampening repetitive neuronal firing. M-channels assemble as tetramers of homomeric Kv7.2 or heteromeric Kv7.2-7.3 subunits and are targets of neuromodulation. Mutations in the KCNQ2 gene, encoding for Kv7.2 subunits, are responsible for epilepsy and neurodevelopmental disorders. Although M-currents critically contribute to neuronal excitability, and their dysfunction is a common epileptogenic mechanism, little is known about how M-channels are regulated. We have identified stargazin, a well-known regulator of AMPA receptors trafficking and gating, as a new interactor of the Kv7.2 subunit of M-channels. Here, we characterized the Kv7.2-stargazin interaction and tested its functional relevance for regulating neuronal excitability.Co-immunoprecipitation and proximity ligation assays revealed that the stargazin-Kv7.2 interaction occurs in neurons. Co-expression of stargazin with Kv7.2 increased the channel surface expression and potentiated Kv7.2-mediated currents, without changing their voltage dependence. Conversely, stargazin silencing in cultured cortical neurons decreased current sensitivity to the M-channel specific blocker XE-991 and reduced the hyperpolarization induced by the M-channel activator retigabine, indicating decreased neuronal M-currents in the absence of stargazin. Stargazin depletion in neurons also impacted the cluster organization of Kv7.2 channels at the nano-structure level, as determined by super-resolution microscopy. Interestingly, a variant of stargazin associated with intellectual disability failed to potentiate M-currents when co-expressed with Kv7.2. Additionally, a knock-in mouse model harbouring this stargazin variant showed decreased M-currents and reduced medium after burst-hyperpolarization in pyramidal subiculum neurons and enhanced susceptibility to pentylenetetrazol-induced seizures.In addition to their contribution to dampening repetitive firing, M-currents impact the organization and position of the axon initial segment (AIS), a structure responsible for clustering voltage-gated ion channels, and which mediates action potential generation. The AIS morphology and plasticity have a critical role in setting proper neuronal excitability. Stargazin knock-down induced a lengthening of the AIS and its distal positioning away from the soma in cultured cortical neurons, and knock-in animals harbouring the intellectual disability-associated form of stargazin displayed abnormal size and positioning of the AIS in subiculum neurons. Moreover, neurons depleted from stargazin showed impaired AIS plasticity upon chronic activity stimulation. These results suggest that stargazin is implicated in the organization and plasticity of the AIS.Collectively, our data support a novel function for stargazin in the control of neuronal excitability through the regulation of M-channel activity and of structural plasticity of the AIS. This role of stargazin may be impaired in neurodevelopmental disorders associated with genetic disruption of stargazin.