Hybrid nanoparticles as multifunctional platform for brain tumor therapy

Abstract

O glioblastoma (GB) é o tumor cerebral primário mais frequente e de natureza mais agressiva. Apesar da sua baixa taxa de incidência em comparação com outros tipos de cancro, apresenta elevada taxa de mortalidade associada ao mau prognóstico. Os tratamentos convencionais, como a ressecção cirúrgica seguida de radioterapia e a quimioterapia com a temozolomida (TMZ) são ineficazes, e não há uma solução definitiva para o GB. Uma das principais estratégias para reduzir a mortalidade desta doença é a sua deteção precoce, seguida de terapia multimodal. Esta última abordagem envolve a conjugação de modalidades distintas de tratamento que atuam sinergicamente e de preferência em diferentes alvos, como por exemplo na heterogeneidade tumoral e nas vias de resistência aos fármacos, contornando as limitações dos tratamentos convencionais. O principal objetivo deste trabalho consistiu em desenvolver nanopartículas híbridas vetorizadas (HNPs), integrando abordagens quimioterapêuticas e fototérmicas para melhorar o tratamento do GB. A novidade desta estrutura baseia-se na combinação das propriedades únicas das nanopartículas (NPs) orgânicas e inorgânicas num único sistema, designado por NPs híbridas. Especificamente, esta tese centra-se no desenvolvimento de nanopartículas híbridas lípido ouro utilizando nanopartículas lipídicas carregadas com celecoxib (como componentes orgânicos e sistema de administração de fármacos) no núcleo e nanopartículas de ouro na forma de bastonete (como componente inorgânico e sistema de entrega de calor) na superfície. Foi ainda incluído um ligando (transferrina) na camada externa das HNPs, na qualidade de estratégia de vetorização, para conferir propriedades específicas de direcionamento para a barreira hematoencefálica/barreira tumoral.O segundo objetivo deste trabalho consistiu em investigar a utilização de celecoxib nas células do glioblastoma como agente quimioterapêutico, ultrapassando as limitações do tratamento associados à TMZ. Celecoxib é um fármaco pouco solúvel em água, e a sua encapsulação em nanopartículas lipídicas (LNPs) representa uma estratégia apelativa para melhorar a eficácia do fármaco e a capacidade para contornar barreiras fisiológicas como a barreira hematoencefálica e a barreira tumoral e, portanto, melhorar o tratamento do glioblastoma.As LNPs foram otimizadas segundo os princípios de Quality by design, o que permitiu obter nanopartículas lipídicas ultrapequenas. Assim, foi alcançada a produção de nanopartículas lipídicas ultra-pequenas (< 100 nm) com um elevado teor de lípidos (15% m/m). A funcionalização da superfície foi efetuada por interação eletrostática, utilizando péptidos de penetração celular, péptidos direcionados para o tumor (c[RGDfK]), e proteínas (transferrina, Tf). Estudos in vitro de viabilidade, permeabilidade, e internalização celulares abordaram a vetorização para a barreira hematoencefálica e barreira tumoral. Observou-se que a Tf mostrou uma melhor permeabilidade através das células da barreira hematoencefálica, e o c[RGDfK] mostrou uma elevada internalização em células de GB.Os nanorods de ouro (AuNRs) foram usados para promover um “ataque físico” às células GB, devido as suas propriedades óticas, eletrónicas e térmicas únicas. Foram desenvolvidos para promover a entrega de calor de forma controlada. Para reduzir o efeito citotóxico associado aos AuNRs revestidos com brometo de cetiltrimetilamónio, a sua superfície foi funcionalizada com cRGDfK, na qualidade de péptido para vectorização para o tumor. Esta funcionalização melhorou a estabilidade e a biocompatibilidade dos AuNRs e foi também utilizada como um elemento de ligação entre os LNPs e os AuNRs, permitindo assim a obtenção de nanopartículas híbridas metal-lípido.As HNPs foram desenvolvidas por uma ligação covalente entre LNPs e AuNRs, e revestidas electrostaticamente com Tf (HNPsTf), como uma estratégia de vetorização para a barreira hematoencefálica. Foram posteriormente avaliadas as propriedades coloidais e o comportamento in vitro e in vivo das HNPs. As HNPsTf apresentaram uma citotoxicidade seletiva mais elevada nas células de GB e uma maior internalização nas células da barreira hematoencefálica nos primeiros 30 minutos do que as HNPs não vetorizadas. Os estudos in vivo de biodistribuição mostraram uma acumulação preferencial no cérebro, com maior tempo médio de residência do que as HNPs não vetorizadas, seguido do fígado e do rim. Além disso, os estudos in vivo em murganhos, integrando um modelo ortotópico de glioblastoma humano, evidenciaram que após irradiação das HNPsTf a sua capacidade antitumoral foi significativamente melhorada, o que resultou numa maior eficiência na inibição do crescimento tumoral e no prolongamento da sobrevida dos animais, juntamento com um melhor perfil de tolerabilidade.Concluindo, estes resultados realçam a eficácia das HNPsTf carregadas com celecoxib, tirando partido da administração de agentes quimioterapêuticos e da terapia fototérmica.

Glioblastoma (GB) is the most common primary brain tumor and the most aggressive in nature. Despite the low incidence rate of GB compared with other types of cancer, it is still a deadly disease with an extremely poor prognosis. Conventional treatments, including surgical resection followed by radiotherapy and temozolomide (TMZ) alkylating chemotherapy are ineffective, and there is no definite solution for GB. One of the key strategies to reduce mortality is its early detection, followed by multimodal therapy. The latter involves the conjugation of distinct treatment modalities that act synergistically and preferably on different targets, such as tumor heterogeneity and resistance pathways, overcoming the shortcomings of current treatments. The main objective of this work was to develop targeted hybrid nanoparticles (HNPs), including a combination of chemo- and photothermal therapy approaches designed to improve the GB treatment. The novelty of this work relies on assembling properties of organic and inorganic nanoparticles (NPs), combined to obtain NPs with unique attributes, designated as hybrid NPs. In particular, this work focuses on the construction of hybrid lipid-gold nanoparticles using celecoxib-loaded lipid nanoparticles (as organic components and drug delivery system) in the core and gold nanorods (as inorganic component and a heat delivery system) in the shell. An endogenous ligand (transferrin) was attached to the outer layer to impart specific targeting properties to BBB.The drug repurposing strategy explores a new therapeutic use for drugs already approved for other clinical indications, which offers several advantages over developing a new drug by reducing the drug development time and resources. The second objective of this work consisted on investigating whether celecoxib could be used as chemotherapeutic drug against glioblastoma cells to overcome the treatment failure associated to TMZ. Celecoxib, a lipophilic COX-2 inhibitor, is a good candidate because it mediates growth inhibitory effects, induces apoptosis, and reduces the risk of the occurrence and progression of several types of cancer, including GB. Celecoxib is a poorly water-soluble drug and loading celecoxib into lipid nanoparticles (LNPs) arises as an appealing strategy to improve drug efficacy and ability to overcome physiological barriers such as BBB and BTB, thereby improving GB therapy.LNPs were optimized following the quality by design (QbD) approach, which yielded small lipid nanoparticles (< 100 nm) with a high lipid content (15% w/w). These characteristics are critical to enhance the permeability through the BBB and a high drug loading capacity. The surface functionalization was performed by electrostatic interaction, using cell-penetrating peptides, tumor-penetrating peptides (c[RGDfK]), or proteins (transferrin). In vitro cellular viability, permeability, and internalization studies explored the targetability to the BBB and BTB. Transferrin was found to assign better permeability through the BBB cells, and c[RGDfK] showed high internalization in GB cells. Gold nanorods (AuNRs) were used to prompt a physical attack on GB cells. AuNRs, plasmonic nanoparticles with unique optical and electronic properties, were developed to promote heat delivery in a controlled way. AuNRs were designed with small particle sizes and a localized surface plasmon resonance wavelength around 760 nm. To reduce the cytotoxic effect of AuNRs coated with cetyltrimethylammonium bromide, the surface was functionalized with the previously studied tumor-penetrating peptide. This active targeting strategy improved the biocompatibility and stability of AuNRs and was also used as a linker between LNPs and AuNRs, resulting in the metal-lipid hybrid nanoparticles.HNPs were developed by covalent linkage between LNPs and AuNRs, and were electrostatically coated with transferrin (designated as HNPsTf). The latter were used as a targeting strategy for the BBB. The colloidal properties and the in vitro and in vivo behaviors of HNPs were also characterized. HNPsTf showed selectively higher cytotoxicity in glioblastoma cells and higher uptake in BBB cells in the first 30 min, in comparison to non-targeted nanoparticles. The in vivo biodistribution studies showed a preferential accumulation in the brain, with a higher mean residence time than non-targeted HNPs, followed by liver and kidney. Moreover, the in vivo experiments in human glioblastoma orthotopic model mice evidenced that after irradiation of HNPsTf, their antitumor ability was significantly enhanced, resulting in a superior efficiency in inhibiting tumor growth and in prolonging the lifespan of animals, along with a better tolerability profile. Overall, these findings highlight the efficacy of celecoxib-loaded HNPsTf in vivo, and the synergistic effect of combining chemotherapeutic drug delivery and photothermal therapy.