Differential regulation of GluN2A- and GluN2B-containing NMDA receptors by BDNF in the plasticity of hippocampal synapses

Abstract

Os receptores ionotrópicos de glutamato medeiam a maior parte da neurotransmissão excitatória no cérebro e desempenham papéis essenciais na regulação da atividade sináptica. Em particular os receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) desempenham um papel importante em muitas formas de plasticidade sináptica. Esses receptores contêm duas subunidades obrigatórias do tipo GluN1 e duas subunidades reguladoras, na maioria dos casos subunidades do tipo GluN2A e/ou GluN2B. O factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é um importante regulador da plasticidade sináptica associada a alterações da atividade das sinapses excitatórias no sistema nervoso central dos mamíferos. O BDNF é um mediador da potenciação sináptica de longa duração (LTP) no hipocampo, em parte devido à estimulação da síntese de proteínas responsáveis pela modulação dos NMDAR. Além disso, a fosforilação de Pyk2 mediada por PKC está envolvida na LTP no hipocampo e potencia a actividade dos NMDAR. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesta cascata de reacções. Neste trabalho investigámos o efeito do BDNF na expressão superficial e na dinâmica dos NMDAR contendo subunidades do tipo GluN2A e GluN2B, os quais desempenham um papel fundamental na plasticidade sináptica.O papel do BDNF libertado em resposta ao aumento da actividade neuronal no controlo da excitabilidade neuronal foi demonstrado em registos com múltiplos microeléctrodos em culturas de neurónios do hipocampo estimulados com um bloqueador dos receptores GABAA (bicuculina), um inibidor dos canais de K+ (4-aminopiridina) e com um co-agonista dos NMDAR (glicina). Em seguida foram efectuadas experiências de imunocitoquímica em condição não permeabilizantes, utilizando anticorpos contra sequências extracelulares das subunidades GluN2A e GluN2B dos NMDAR, com o objectivo de avaliar o efeito do BDNF na expressão dos NMDAR na membrana plasmática na sinapse em neurónios do hipocampo em cultura. A incubação com BDNF aumentou a expressão sináptica de ambas as subunidades, ainda que com uma cinética diferente. Verificou-se também que o efeito do BDNF na acumulação sináptica de NMDAR com subunidades GluN2A depende da síntese de proteínas, resultado semelhante ao anteriormente descrito para a regulação das subunidades GluN2B. Além disso, mostrámos que a inibição dos NMDAR contendo subunidades do tipo GluN2B bloqueia completamente o efeito facilitador do BDNF nas sinapses da região CA1 do hipocampo submetidas a estimulação do tipo ‘theta-burst’. A segunda parte do trabalho teve por objectivo investigar os mecanismos de sinalização intracelular responsáveis pela acumulação dos NMDAR na sinapse em resposta à estimulação com BDNF. A supressão dos níveis da cinase de resíduos de tirosina Pyk2 (non-receptor protein proline-rich tyrosine kinase 2) e da proteína de ligação ao RNA hnRNP K (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) eliminou os efeitos do BDNF na expressão sináptica dos NMDAR contendo subunidades GluN2A em neurónios do hipocampo em cultura. Estes resultados são semelhantes aos anteriormente descritos para a regulação sináptica das subunidades GluN2B. Além disso, experiências de Western blot mostraram que a fosforilação de Pyk2 induzida por BDNF foi suprimida na presença do inibidor de PKC CÖ6983. Tendo em conta os resultados das experiências de imunocitoquímica acima descritos colocámos a hipótese de que a acumulação sináptica dos NMDAR em resposta à estimulação com BDNF poderia resultar de alterações na dinâmica dos receptores ao nível da membrana plasmática. Para responder a essa questão investigámos a trajectória dos NMDAR contendo subunidades GluN2A e GluN2B ao nível da membrana plasmática, utilizando ‘quantum dots’. A incubação com BDNF reduziu a mobilidade das duas subunidades no compartimento extrassináptico assim como ao nível sináptico. A redução dos níveis da cinase Pyk2 exibiu efeitos opostos sobre a mobilidade de NMDAR contendo GluN2A e GluN2B após estimulação de BDNF. Enquanto a redução dos níveis de PyK2 induziu um aumento da mobilidade na membrana plasmática dos receptores contendo a subunidade GluN2A, o movimento superficial dos NMDAR constituídos pela subunidade GluN2B diminuiu nas mesmas condições. Em conjunto, esses resultados mostram que o BDNF induz a ativação/fosforilação sináptica da cinase Pyk2 por um mecanismo envolvendo a PKC, resultando num aumento da expressão sináptica de NMDAR contendo subunidades GluN2A e GluN2B; este efeito do BDNF foi também mediado pela proteína hnRNP K. Esta via de sinalização pode mediar os efeitos do BDNF na plasticidade sináptica e pode constituir um novo alvo terapêutico para restaurar os déficits cognitivos característicos de várias doenças do cérebro.

Ionotropic glutamate receptors mediate most excitatory neurotransmission in the brain and play essential roles in the regulation of synaptic activity. N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) mediate many forms of synaptic plasticity. These receptors contain two obligatory GluN1 subunits and two regulatory subunits, in most cases a combination with GluN2A and/or GluN2B. The brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has emerged as a major regulator of activity-dependent plasticity at excitatory synapses in the mammalian central nervous system. BDNF plays an important role in long-term synaptic potentiation (LTP) in the hippocampus, in part due to the upregulation of translation activity, thereby modulating NMDAR. Moreover, PKC-mediated phosphorylation of Pyk2 is involved in hippocampal LTP and acts to potentiate NMDAR function. However, little is known about the molecular mechanisms involved. In this work we investigated the effect of BDNF on the surface expression and dynamics of GluN2A- and GluN2B containing NMDAR, which may play a key role in synaptic plasticity.The role of activity-dependent release of endogenous BDNF in the control of neuronal excitability was first demonstrated with microelectrode array recordings of cultured hippocampal neurons stimulated with a cocktail including a blocker of GABAA receptors (bicuculline), an inhibitor of K+ channels (4-aminopyridine) and a co-agonist of NMDAR (glycine). Immunocytochemistry experiments, under non-permeabilizing conditions, using antibodies against extracellular sequences of the NMDAR subunits GluN2A and GluN2B, were then performed to determine the effects of BDNF on the synaptic surface expression of the receptors in cultured hippocampal neurons. The results showed that treatment with BDNF increased the synaptic surface expression of both GluN2A and GluN2B subunits with a distinct kinetics, and that the BDNF-induced expression of GluN2A was protein synthesis dependent. Furthermore, we showed that inhibition of GluN2B-containing NMDAR fully abrogated the BDNF-induced facilitation of CA1 hippocampal synapses under conditions of theta-burst stimulation. In the second part of the work, we focused our study on the understanding of the signaling mechanisms involved in the synaptic accumulation of NMDAR following stimulation with BDNF. The knockdown of the non-receptor protein proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNP K) abolished the effect of BDNF in the upregulation of the synaptic expression of GluN2A in cultured hippocampal neurons. Moreover, western blot analysis showed that BDNF-induced phosphorylation of Pyk2 was abrogated in the presence of PKC inhibitor CÖ6983, showing that the latter kinase mediates the activation of Pyk2 by BDNF. Finally, based on the immunocytochemistry results, we hypothesized that the BDNF-induced increase in the synaptic surface expression of GluN2A- and GluN2B-containing NMDAR could be associated with alterations in the dynamics of the two populations of receptors on the plasma membrane. Incubation with BDNF reduced the mobility of the two subunits in the extrasynaptic and in the synaptic compartment. However, knockdown of Pyk2 displayed opposite effects on the mobility of GluN2A- and GluN2B-containing NMDAR upon BDNF stimulation. The reduction of Pyk2 levels decreased the surface trafficking of GluN2B-containing NMDAR, whereas GluN2A-containing NMDAR showed higher mobility on the plasma membrane. Taken together, these results show that BDNF induces synaptic activation/phosphorylation of Pyk2 by a mechanism involving PKC, resulting in an upregulation in the synaptic expression of GluN2A- and GluN2B-containing NMDAR. The latter effects are mediated by the RNA binding protein hnRNP K, which is in accordance with the requirement of protein synthesis for the synaptic accumulation of both populations of receptors. However, there were several differences in the BDNF-induced regulation of the two subunits, which suggest a role for distinct signaling mechanisms: (I) BDNF showed a faster effect on the increase of GluN2A-containing NMDAR on the surface when compared with GluN2B-containing NMDAR involving common proteins such as Pyk2, PCK and hnRNP K; (II) GluN2B-containing NMDAR appeared to be important in the BDNF-induced enhancement of LTP; (III) GluN2A-containing NMDAR surface mobility was reduced in hippocampal neurons knockdown for Pyk2 after BDNF stimulation, in contrast with GluN2B-containing NMDAR which displayed higher surface trafficking under the same conditions. The pathways described in this work may contribute to a novel therapeutic strategy to restore the cognitive deficits characteristic of various brain disease.