A novel nanoparticle formulation for combined gene therapy and chemotherapy application in hepatocellular carcinoma

Abstract

O cancro do fígado é a sexta causa mais comum de cancro e a terceira principal causa de morte por cancro em todo o mundo, sendo que o carcinoma hepatocelular (CHC) corresponde a cerca de 90% dos tumores primários de fígado. Atualmente, o transplante hepático e a ressecção cirúrgica são as abordagens terapêuticas mais eficazes para doentes com CHC em estádios iniciais. No entanto, na grande maioria dos doentes com CHC o diagnóstico é feito num estádio avançado da doença. Nestes casos, a administração de fármacos quimioterapêuticos corresponde ao tratamento mais comum, embora apenas prolongue ligeiramente a sobrevivência dos doentes. Deste modo, os doentes com estádios avançados de CHC têm um prognóstico reservado, o que faz com que a taxa de incidência do CHC seja praticamente igual à taxa de mortalidade. O CHC é uma doença extremamente complexa e, de facto, o estudo do genoma e epigenoma dos tumores têm demonstrado que a hepatocarcinogénese está associada a várias alterações genéticas e epigenéticas com desregulação de múltiplas vias de sinalização celular que controlam processos celulares importantes, como a proliferação, o ciclo celular, a diferenciação e a sobrevivência celular. Neste contexto, o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais focadas nestas vias de sinalização pode contribuir de forma substancial para o melhoramento do prognóstico do CHC. A combinação de diferentes fármacos que inibam vias de sinalização cruciais à hepatocarcinogenese ou a combinação da expressão de transgenes supressores de tumores com fármacos inibidores das referidas vias de sinalização pode resultar num elevado efeito antitumoral. No entanto, tanto os fármacos como os ácidos nucleicos carecem de nanoestruturas funcionais que permitam, entre outras propriedades, melhorar a estabilidade destes agentes terapêuticos, aumentar a sua especificidade e eficiência de entrega às células alvo, e minimizar os seus efeitos secundários. Neste sentido, o principal objetivo deste trabalho consistiu em desenvolver nanossistemas híbridos (HNP) com capacidade para entregar diferentes agentes terapêuticos, de forma eficiente e específica, a células de CHC. Foram desenvolvidas duas formulações, uma com capacidade para transportar de forma eficiente dois fármacos quimioterapêuticos, e a outra com capacidade para transportar de forma eficiente um plasmídeo de DNA e dois fármacos. A primeira formulação dos HNP consiste num núcleo de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) revestido por uma bicamada lipídica contendo o ligando GalNac para permitir uma interação especifica com o recetor das asialoglicoproteinas, sobreexpresso nas células de CHC. No núcleo de PLGA foi encapsulado o selumetinib, um inibidor alostérico potente e seletivo da MEK1/2, cuja ativação é essencial para a proliferação celular. Na bicamada lipídica foi encapsulado o sorafenib, um inibidor de múltiplas proteínas quinases, utilizado no tratamento sistémico de primeira linha no CHC. Os nossos resultados demonstraram que este nanossistema apresenta propriedades físico-químicas adequadas, nomeadamente tamanho reduzido, elevada estabilidade e grande capacidade de carga para ambos os fármacos. Além disso, este HNP demonstrou ter capacidade para contornar a resistência aos fármacos e apresentou elevada especificidade, promovendo grandes níveis de morte em células de CHC, mas não em células não tumorais. Adicionalmente, esta formulação permitiu potenciar o efeito antitumoral dos fármacos co-encapsulados, através do aumento da morte celular programada, que ocorreu não só em culturas celulares 2D como em culturas celulares 3D. Por sua vez, o segundo HNP desenvolvido consistiu num núcleo de PLGA, no qual foi encapsulado o selumetinib, revestido com um plasmídeo de ADN contendo o transgene PTEN e uma bicamada lipídica sensível ao pH contendo o fármaco perifosina e o ligando GalNAc, para permitir a interação com o recetor das asialoglicoproteínas. O transgene PTEN codifica a proteína supressora tumoral PTEN e a perifosina é um inibir da AKT cuja ativação é essencial para a sobrevivência celular. Os nossos resultados mostraram que esta formulação apresenta não só uma elevada capacidade de transporte dos dois fármacos como também do material genético, permitindo uma expressão eficiente do transgene PTEN nas células alvo. Além disso, este nanossistema possui elevada estabilidade, propriedades físico-químicas adequadas, e elevada especificidade para as células de HCC. Esta formulação resultou num elevado efeito antitumoral, combinando a quimioterapia com a terapia génica, observando-se não só um aumento da morte celular programada como uma diminuição da proliferação celular, quer em culturas celulares 2D quer nas 3D. Globalmente, os nanossistemas híbridos desenvolvidos neste trabalho, juntamente com as estratégias terapêuticas por eles mediadas, constituem plataformas promissoras para a geração de novas abordagens terapêuticas para o CHC.

Liver cancer is the sixth most common cause of cancer and the third leading cause of cancer death worldwide, with hepatocellular carcinoma (HCC) accounting for about 90% of primary liver tumors. Presently, liver transplantation and surgical resection are the most effective therapeutic approaches for patients with early stage HCC. However, in the vast majority of patients with HCC the diagnosis is made in advanced stages of the disease. In these cases, the administration of chemotherapeutic drugs corresponds to the most common treatment, although it only slightly improve the survival of these patients. Therefore, patients with advanced stages of HCC have a poor prognosis, which makes the HCC incidence rate practically equal to the mortality rate. HCC is a very complex disease and, in fact, genome and epigenome studies of tumors have demonstrated that hepatocarcinogenesis is associated with several genetic and epigenetic alterations with dysregulation of multiple cell signaling pathways that control important cellular processes, such as proliferation, cell cycle, differentiation and cell survival. In this context, the development of new antitumor strategies focused on these signaling pathways could substantially contribute to improve the prognosis of HCC. The combination of different chemotherapeutic drugs that inhibit crucial signaling pathways of hepatocarcinogenesis or the combination of tumor suppressor transgenes expression with different drugs that inhibit the referred signaling pathways may result in high antitumor effect. However, both drugs and nucleic acids lack of functional nanostructures that allow, among other properties, to improve the stability of these therapeutic agents, to increase their delivery specificity and efficiency to target cells, and to minimize their side effects. In this regard, the main objective of this work was to develop hybrid nanosystems (HNP) capable of efficiently and specifically delivering different therapeutic agents to HCC cells. Two formulations were developed, one with the ability to efficiently transport two chemotherapeutic drugs; and the other one with the capacity to efficiently transport a DNA plasmid and two drugs. The first HNP formulation consists of a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) core coated with a lipid bilayer containing the GalNac ligand to allow a specific interaction with the asialoglycoprotein receptor, which is overexpressed in HCC cells. The drug selumetinib, a potent and selective allosteric inhibitor of MEK1/2, whose activation is essential for cell proliferation, was encapsulated in the PLGA core. On the other hand, the drug sorafenib, an inhibitor of multiple protein kinases that is used in the first line systemic treatment of HCC, was encapsulated in the HNP lipid bilayer. Our results demonstrated that the developed nanosystem has adequate physicochemical properties for drug delivery, namely small mean diameters, high stability, and high loading capacity for both drugs. Furthermore, this HNP exhibited the ability to circumvent drug resistance and presented high specificity, promoting high levels of death in HCC cells, but not in non-tumor cells. Moreover, this formulation allowed to potentiate the antitumor effect of co-encapsulated drugs, by increasing programmed cell death, which occurred not only in 2D cell cultures but also in 3D cell cultures. In turn, the second developed HNP consisted of a PLGA core, in which selumetinib was encapsulated, coated with a DNA plasmid containing the PTEN transgene and a pH-sensitive lipid bilayer containing the drug perifosine and the GalNAc ligand, to allow interaction with the asialoglycoprotein receptor. The PTEN transgene encodes the PTEN tumor suppressor protein, and perifosine is an AKT inhibitor whose activation is essential for cell survival. Our results showed that this HNP formulation has not only a high capacity to transport both drugs but also the genetic material, allowing the efficient expression of the PTEN transgene in target cells. In addition, this nanosystem has high stability, suitable physicochemical properties, and high specificity for HCC cells. This formulation resulted in a high antitumor effect, by combining chemotherapy with gene therapy, being observed not only an increase in programmed cell death but also a decrease in cell proliferation, both in 2D and 3D cell cultures. Overall, the hybrid nanosystems developed in this work, together with the therapeutic strategies mediated by them, constitute promising platforms for the generation of novel therapeutic approaches to HCC.