Extracellular vesicles: from brain communication to therapeutic delivery

Abstract

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas membranares com uma bicamada lipídica produzidas por todos os tipos celulares através de um processo conservado ao longo da evolução que permite a comunicação a curtas e longas distâncias. Esta comunicação acontece como resultado do material transportado pelas EVs, nomeadamente proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, que se podem encontrar à superfície das EVs ou protegidos no seu lúmen. De facto, o conteúdo das EVs pode fornecer informações sobre o estado da célula de origem e modular respostas na célula recetora, razão pela qual estas partículas produzidas na natureza têm atraído grande interesse no campo do diagnóstico, como de biomarcadores e também para potenciais aplicações terapêuticas. O termo EVs é usado de forma geral para uma população heterogénea de partículas que podem ser tipicamente categorizadas por tamanho e biogénese em exossomas, microvesículas e corpos apoptóticos. Desvendar o papel das EVs no cérebro e como se difundem nos biofluídos corporais para comunicar a longas distâncias permanece ainda insuficientemente compreendido. A clarificação da natureza e das propriedades das EVs permitirá explorar a capacidade natural destas como veículos de entrega terapêutica, um campo desafiante que ainda está a dar os seus primeiros passos. Por este motivo, o objetivo deste projeto foi contribuir para clarificar o papel das EVs na comunicação cerebral, investigando métodos de deteção no cérebro e na periferia, bem como explorando a sua capacidade natural de entregar sequências silenciadoras ao cérebro e assim reduzir os níveis de mRNA da ATXN3 mutante após administração intranasal das EVs.A primeira parte deste projeto encontra-se descrita no capítulo 2, onde desenvolvemos um método inovador e sensível para desvendar o papel que as EVs cerebrais endógenas desempenham na comunicação do cérebro. Para isso, geramos um sistema Cre/LoxP que regista permanentemente a internalização das EVs funcionais in vivo ao longo do tempo. De forma notável, a fonte cerebral que segrega EVs de forma contínua demonstra entregar o seu conteúdo de forma funcional noutras regiões do cérebro, um processo que se acentua com o tempo de exposição, dando pistas sobre o papel das EVs na comunicação do cérebro bem como para futuras terapias baseadas em EVs direcionadas ao sistema nervoso central (SNC). Além disso, as EVs cerebrais contendo mRNA da Cre e isoladas de tecido cerebral provaram ser funcionais na entrega do seu conteúdo in vitro.No capítulo 3, desenvolvemos uma ferramenta multifacetada, que designamos NoMi, com o objetivo de monitorizar o estado das células cerebrais num animal vivo através da análise das EVs que se difundem do cérebro para os fluidos periféricos. Para este efeito recorremos a uma construção lentiviral que contém a estrutura da tetraspanina CD63 associada aos marcadores Flag, Nanoluc e mCherry, o que melhora a deteção, sensibilidade e robustez na captura de EVs cerebrais no sangue. Demonstrámos a capacidade desta plataforma para fornecer informações sobre as EVs produzidas e disseminadas nos biofluidos complexos, mediante caracterização do conteúdo em proteínas e RNAs das EVs NoMi imunocapturadas. No capítulo 4, focámo-nos em processos de bioengenharia para desenvolver EVs modificadas que alcançassem o cérebro e desempenhassem funções terapêuticas no combate à Doença de Machado-Joseph (DMJ) após administração intranasal. Observámos que as sequências silenciadoras quando associadas a sequências específicas designadas de ExoMotifs e à ribonucleoproteína A2B1 (hnRNPA2B1) são altamente enriquecidas em EVs. Além disso, as EVs foram modificadas na sua superfície para expressar a proteína de fusão PDGFR-RVG que as direciona para neurónios, onde demonstraram ser terapeuticamente ativas no silenciamento do mRNA da ATXN3 mutante in vitro e in vivo após administrações intranasais diárias.Em resumo, este trabalho evidencia o potencial das EVs na comunicação cerebral entre regiões próximas e distantes, fornecendo informações sobre o estado do cérebro através da análise do conteúdo das suas EVs, nos fluidos periféricos de um animal vivo. Além disso, os nossos dados sugerem que o enriquecimento de conteúdo terapêutico nas EVs constitui uma estratégia eficiente, que permite usar as EVs como veículos de entrega para o cérebro no tratamento de DMJ/SCA3 e em outras doenças do cérebro.

Extracellular vesicles (EVs) are membrane particles with a lipid bilayer secreted by all cell types as a process conserved throughout evolution to communicate at close and long distances. This communication happens as result of the material carried by EVs, such as proteins, lipids and nucleic acids, either exposed on EVs surface or protected in their lumen. In fact, EVs cargo can provide information about the state of the cell of origin and modulate responses in the recipient cell, reason why these naturally produced particles are of upmost interest in diagnostic and biomarkers fields and for therapeutic applications. EVs are a general term for a heterogenous population of particles typically categorized by size and biogenesis process into exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. Unravelling the role of EVs within the brain and how they diffuse throughout complex biofluids to communicate at long distances remains poorly understood. Understanding the nature and properties of EVs will also allow to explore the natural capacity of EVs as delivery vehicles for therapeutics, a challenging field still making its first steps. For that reason, the aim of this project has been to understand the function of EVs in brain communication by investigating their biodistribution within the brain and periphery as well as to explore their natural capacity to deliver silencing sequences to the brain and downregulate mutATXN3 mRNA upon intranasal administration. In the first part of this project, described in chapter 2, we developed an innovative and sensitive method to unravel the role of endogenous bdEVs in brain communication. For that aim, we generated a Cre/LoxP based system which permanently records in vivo functional uptake of EVs over time. Remarkably, a brain source of EVs permanently secreting particles is shown to impact the functional outcome within other regions of the brain as time of exposure increases, shedding light on the role of EVs and providing clues for EV-based therapies targeting the CNS. Moreover, bdEVs carrying Cre mRNA and isolated from brain tissue were proven to deliver their functional cargo in vitro. In chapter 3, we developed a multiplex reporter tool, which we designated NoMi, to address the challenge of monitoring the status of brain cells through investigation of the released EVs in the brain and periphery of a living animal. This is a transducible construct tagging tetraspanin (TSN) CD63 with Flag, Nanoluc and mCherry tags to increase detection, sensitivity, and robustness in capturing bdEVs in blood. We proved the usefulness of NoMi platform in giving insights about bdEVs secretion and spread in complex biofluids by exploiting the protein and exRNA cargo in serum-immunocaptured NoMi-EVs.In chapter 4, we used knowledge of the brain dysfunction in MJD/SCA3 to develop bioengineered EVs with therapeutic properties to alleviate disease hallmarks in vivo upon intranasal administration. We found that silencing sequences associated with a vesicle-packaging system – an ExoMotif, and the ribonucleoprotein A2B1 (hnRNPA2B1) promote packaging into EVs. Moreover, EVs engineered on their surface to express PDGFR-RVG were shown to target neurons and to be therapeutically active for silencing mutATXN3 mRNA in vitro and in vivo upon daily intranasal administration.In summary, this work provides a step forward to understanding the potential role of EVs in brain communication in close and distant compartments by giving insights about the brain status of a living animal in biofluids through the characterization of secreted bdEVs and of their cargo. Moreover, our data suggest that loading therapeutic cargoes in EVs is an efficient strategy, turning EVs into promising delivery vehicles to reach the brain for treatment of MJD/SCA3 and other brain disorders.