DEVELOPMENT OF A STRATEGY FOR A TARGETED DELIVERY OF EXTRACELLULAR VESICLES TO THE INFARTCTED HEART

Abstract

Myocardial infarction (MI) results from an imbalance in the oxygen supply-demand ratio after a blockage of the coronary artery. Prolonged ischemia induces massive cardiac tissue necrosis followed by the replacement of dead cardiomyocytes by fibrotic tissue. One of the advanced therapies being tested for the treatment of MI is small extracellular vesicles (sEVs). These vesicles are naturally released by cells, and they have been shown to regulate cardiac regeneration. One of the main limitations of sEV-based therapies for cardiovascular diseases stands on their limited retention in the heart. Membrane modification of sEVs may be an interesting strategy to control their biodistribution while assuring the delivery to the cardiac tissue. Surface modification of sEVs with ligands that allow biorthogonal chemistry interactions with the desired target is particularly promising because these reactions can occur in vivo without raising cytotoxicity issues and because they are fast and highly selective. The main goal of this work was to develop an innovative strategy to induce targeted delivery and accumulation of sEVs in the ischemic region of an infarcted heart. To fulfil this goal, sEVs’ surface was modified so that vesicles could interact through click chemistry with entities shown to be upregulated upon MI: specific cell surface glycans or urokinase plasminogen activator receptor (uPAR). In the context of this work, two targeting strategies were tested. The first one was based on metabolic labelling of cell surface glycans with azido sugars, while the second one was based on a reagent modified antibody (uPAR antibody conjugated with DBCO-NHS) with affinity for uPAR. In both cases, membrane modified-sEVs could establish a click reaction with those targeting modalities (azido sugars and modified uPAR antibody, respectively). Nevertheless, only the uPAR-based strategy was shown to be suitable for a MI context, as it was not possible to demonstrate upregulation of azido sugars in pathological conditions. Overall, the results obtained indicate that novel cardiac targeting strategies can be developed by modifying sEVs surface, where click chemistry reactions can be exploited as intermediates to assure sEVs interaction with the respective overexpressed biomarker in the desired target. Moreover, the foundation of this work can be easily applied in other pathologies where specific markers upregulation is well established.

O enfarte do miocárdio (EM) resulta de um desequilíbrio entre o fornecimento e a necessidade de oxigénio após a obstrução de uma artéria coronária. Isquemia prolongada resulta em necrose do tecido cardíaco e, consequente, cicatrização por fibrose miocárdica. Uma das terapias avançadas que está a ser testada para o tratamento do EM são pequenas vesículas extracelulares (sEVs). Estas vesículas são naturalmente exocitadas pelas células e têm a capacidade de regular a regeneração cardíaca. Uma das principais limitações de terapias cardiovasculares baseadas em sEVs reside na sua retenção limitada no coração. A modificação da membrana plasmática das sEVs pode ser uma estratégia interessante tanto para controlar a sua biodistribuição como para assegurar a entrega no tecido cardíaco. A modificação da superfície das sEVs com entidades que permitem interações biortogonais com o alvo desejado é particularmente promissora, uma vez que essas reações podem ocorrer in vivo de forma rápida, seletiva e sem citotoxicidade associada. O principal objetivo deste trabalho era desenvolver uma estratégia inovadora para garantir a entrega dirigida e acumulação de sEVs na região isquémica de um coração pós-infarte. Para atingir este objetivo, a superfície das sEVs foi modificada de forma que as vesículas pudessem interagir através de química de clique com componentes cuja expressão está aumentada após um EM. Glicanos específicos expressos na superfície das células ou o receptor de superfície do ativador do plasminogénio da uroquinase (uPAR) têm vindo a ser considerados biomarcados do EM. Durante este estudo, foram testadas duas estratégias de entrega dirigida, sendo que a primeira se foca na marcação metabólica de glicanos com açúcares com grupos azida, enquanto a segunda tem como base um anticorpo modificado (anticorpo uPAR conjugado com DBCO-NHS) com afinidade para o uPAR. Em ambos os casos, as sEVs cuja membrana foi modificada estabeleceram uma reação de clique com essas entidades (açúcares com grupos azida e anticorpo uPAR modificado). No entanto, apenas a estratégia baseada no uPAR demonstrou ser adequada para um contexto de EM, uma vez que não foi possível demonstrar a expressão aumentada dos açúcares em condições patológicas. No geral, os resultados obtidos indicam que podem ser desenvolvidas novas estratégias de entrega dirigida ao coração através da modificação da superfície das sEVs, explorando as reações de química de clique como intermediários para assegurar a interação das sEVs com o biomarcador sobre-expresso no alvo desejado. Além disso, as bases deste trabalho podem ser facilmente aplicadas a outras patologias em que a expressão aumentada de marcadores específicos esteja bem estabelecida.