Understanding the role of extracellular vesicles derived from mutant KRAS colorectal cancer cells on T-cell activation and exhaustion

Abstract

Colorectal cancer is, nowadays, the third type of cancer with highest rates of incidence, and the second deadliest. Among these cases, about 40% have mutations in KRAS, a gene that when mutated induces immune escape and cancer progression. Clinically, a KRAS inhibitor has already been introduced, but, although initially it reverses oncogenic KRAS-induced immunosuppression, tumors recur shortly after treatment begins, suggesting that alternative immunosuppressive mechanisms exist to impair an effective anti-tumor response. Our understanding on those mechanisms is insufficient, and clearly needs to be attained in order to improve treatment efficacy and patients’ overall survival.Aiming to identify mediators of immunosuppression upon KRAS inhibition, we focused in understanding if extracellular vesicles (EVs) released from colorectal cancer cells harboring KRAS mutation can alter the phenotype of activation/exhaustion of T cells, as a potential immune invasion mechanism.Considering the well-known role of microRNAs on cell communication and their presence in EVs, we started by performing an in-silico analysis to identify microRNAs that target immune checkpoint molecules, through database and with publicly available microRNA sequencing data from colorectal cancer isogenic cell lines and of the corresponding EVs (DLD-1: KRAS wild-type and mutated alleles; DKs-8: only KRAS wild- type allele, mimic the inhibition of KRAS).Thus, we hypothesize that the deregulation of microRNAs targeting immune checkpoint molecules that accompanies KRAS inhibition is likely to promote exhaustion (inactivation) of infiltrating T cells, thus triggering tumor immune evasion.To validate this hypothesis, we started by quantifying EVs in the conditioned media from 3D and 2D cultures, with or without KRAS silenced. We observed a higher amount of EVs from 2D to 3D conditions, meaning that 2D culture cells, produce less extracellular vesicles. Further, 3D cultures of KRAS-silenced cells secreted significantly less EVs than control cells. More so, despite no significant differences were observed in terms of RNA amount carried by EVs from 2D and 3D cultures, a tendency for an increase of RNA, smallRNAs and microRNAs enclosed in the EVs secreted by KRAS-silenced cells was observed. We also observed a direct correlation between the total RNA, smallRNAs or microRNAs carried by EVs by 2D and 3D cultures of KRAS-silenced and control cells.To evaluate the role of EVs-enclosed microRNAs on T-cell exhaustion upon KRAS-inhibition we treated T-cells with conditioned media derived from 3D cultures of KRAS-silenced and control cells. T-cells seem to be activated upon treatment with conditioned medium of KRAS mutated CRC (control) cells, as a higher expression of CD69 was observed by flow-cytometry, T-cells exhaustion markers were evaluated – CTLA-4, TIGIT, PD-1 and PD-L1 – but no differences were observed in their expression levels between the different conditions, implicating a lack of exhaustion on T-cells. However, PD-1 and PD-L1 showed a tendency to be downregulated in T-cells treated with conditioned medium from KRAS mutation silenced CRC cells, implying a role of G13D KRAS mutation in promoting T-cell exhaustion. Such effect is possibly mediated by EVs, since in the majority of the results, the depletion of EVs from the conditioned medium, abolished the observed differences. In summary, this work tried to provide mechanistic insight on the mechanisms governing immune evasion upon KRAS-inhibition. It will certainly lead to future studies aiming to validate the identified microRNAs as biomarkers to identify patients that may benefit from KRAS-inhibition and immunotherapy combinatorial treatment.

O cancro colorretal é, atualmente, o terceiro tipo de cancro com maiores taxas de incidência, sendo também o segundo cancro mais mortal. Entre estes casos, cerca de 40% tem mutações no KRAS, um gene que quando mutado induz escape imunológico e progressão cancerígena. Clinicamente, já estão a ser utilizados inibidores de KRAS, mas, apesar de inicialmente reverterem a imunossupressão induzida pelo KRAS mutado, os tumores recorrem pouco tempo depois do início do tratamento, sugerindo a existência de mecanismos imunossupressores alternativos que prejudicam a eficiências das respostas anti-tumorais. Sabe-se ainda muito pouco em relação a estes mecanismos, pelo que é claramente necessário a sua compreensão de forma a podermos melhorar a eficácia dos tratamentos e a sobrevivência dos doentes. Com o objetivo de identificar mediadores da imunossupressão após a inibição do KRAS, focamo-nos em compreender se as vesículas extracelulares (EVs) libertadas por células do cancro colorretal com KRAS mutado poderiam alterar o fenótipo de ativação/exaustão de células T, como um potencial mecanismo de evasão imune. Considerando o já conhecido papel dos microRNAs na comunicação celular e a sua presença em EVs, começamos por realizar uma análise in-silico para identificar microRNAs que alvejam moléculas de controlo imune, através de dados de base e com dados de sequenciação de microRNAs, disponíveis ao público, de linhas isogénicas de cancro colorretal e dos seus correspondentes EVs (DLD-1: alelos KRAS wild-type e mutado; DKs-8: apenas o alelo KRAS wild- type, mimetizando assim a inibição do KRAS). Assim sendo, foi hipotetizado que a desregulação dos microRNAs que alvejam moléculas de controlo imune que acompanham a inibição do KRAS terá um papel na promoção de exaustão (inativação) de células T infiltradas, e assim despoletando a evasão imune tumoral.Para validar esta hipótese, começamos por quantificar EVs em meios condicionados de culturas 2D e 3D, com ou sem o KRAS silenciado. Observamos maiores concentrações de EVs em culturas 3D, comparado com as culturas 2D, demonstrando que as culturas 2D produzem menos vesículas extracelulares. Demonstramos ainda que, em culturas celulares 3D, com a inibição do KRAS, secretam menos EVs do que as células controlo.Ainda assim, apesar de não se terem observado diferenças significativas no que toca à quantidade de RNA transportado pelas EVs de culturas 2D para 3D, há uma tendência para o aumentos de RNA, pequenos RNAs e microRNAs no interior das EVs quando o KRAS mutado é silenciado. Observamos ainda uma correlação direta entre o RNA total, pequenos RNAs ou microRNAs transportados por EVs em condições 2D e 3D de células controlo ou com KRAS silenciado. Para avaliar o papel dos microRNAs transportados nas EVs na exaustão de células T após a inibição do KRAS, tratamos células T com meio condicionado derivado de culturas 3D de células controlo e com KRAS silenciado. As células T parecem ser ativadas após o tratamento com meios condicionados de células de CRC com KRAS mutado (controlo), uma vez que foram observadas maiores expressões de CD69 por citometria de fluxo. Os marcadores de exaustão de células T foram avaliados – CTLA-4, TIGIT, PD-1 e PD-L1 – mas não foram observadas diferenças nos seus níveis de expressão entre as diferentes condições, sugerindo a ausência de exaustão nas células T. No entanto, o PD-1 e o PD-L1 mostraram uma tendência a estarem subexpressos em células T tratadas com meios condicionados de células de CRC com KRAS mutado silenciado, sugerindo um papel do KRAS G13D mutado na promoção de exaustão de células T. Este efeito é possivelmente mediado por EVs, dado que a maioria dos resultados deixaram de ter diferenças entre condições quando os EVs foram depletados dos meios condicionados. Em suma, este trabalho, ainda que muito no início, visou fornecer novos conhecimentos mecanísticos nos mecanismos de evasão imune após a inibição do KRAS. E irá eventualmente levar a estudos futuros que irão visar a validação dos microRNAs identificados como biomarcadores para identificar pacientes que poderão beneficiar da inibição do KRAS e tratamentos com combinação de imunoterapia.