Differential loading protocols of dendritic cells to improve cancer immunotherapy

Abstract

Dendritic cells (DCs) are powerful antigen-presenting cells responsible for identifying, processing, and presenting antigens to T cells. They bridge the gap between the innate and adaptive immune systems. In addition to inducing an immune response, they are important for inducing immune tolerance. These characteristics make these cells excellent candidates for the development of new immunotherapies, specifically antitumor dendritic cell vaccines. Progress in identifying new and potential antigens present in tumor cells has led to the development of several DC vaccines using different targets. However, despite being safe and immunogenic, clinical results have not been as expected. Among the various reasons already described, the type of antigen and the DC loading strategy selected can have a major impact on the DC presentation capacity, as well as the interaction and activation of lymphocytes, thus impacting the cytolytic capacity of T lymphocytes. Thus, the main objective of this study was to evaluate different DC loading strategies and determine which strategy promotes greater T cell activation as well as a greater cytotoxic response when cultured with tumor cells. Flow cytometry was used to evaluate the protein levels of different antigens in various tumor cell lines. The production of proinflammatory and anti-inflammatory markers was also assessed by RT-PCR. After identifying the optimal concentration of 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA-Cdr), which led to the highest increase in antigen protein levels, the impact of this treatment on the expression of inflammatory markers and protein levels of some tumor antigens were also evaluated. In the second part of the study, the ability of T lymphocytes co-cultured with DCs loaded with different sources of antigens to induce specific tumor cell death was also evaluated. To accomplish this, two strategies were employed, namely the lactate dehydrogenase (LDH) release assay and Fluorescence-activated cell sorting (FACS). To determine the presence of specific T-cell clones, the release of interferon (IFN)-γ after culturing with a specific stimulus was quantified. The results showed that 5-AZA-Cdr promoted an increase in the protein levels of certain cancer/testis-specific antigens (CTAs) and inflammatory mediators. With regard to cytotoxicity assays, FACS provided more specific and sensitive results than the LDH release assay, considering the low percentage of cytotoxic T lymphocyte clones (CTL) obtained, as demonstrated by the IFN-γ release results.In summary, this work highlights the importance of selecting the appropriated tumor antigen and the loading strategy in promoting greater lymphocyte activation and, in turn, greater tumor cell death. It also revealed that the method through which tumor death is assessed is important and the results achieved can vary depending on the conditions tested, and the most sensitive methods should be selected and used.

As células dendríticas (CDs) são potentes células apresentadoras de antigénio, responsáveis pela identificação, processamento e apresentação de antigénios aos linfócitos T, realizando a ponte entre o sistema imune inato e o adaptativo. Para além de induzirem uma resposta imunitária, são também importantes na indução de tolerância imunológica. Estas características fazem das CDs, ótimas candidatas para o desenvolvimento de novas imunoterapias, em concreto, de vacinas de células dendríticas anti-tumorais. O progresso que tem sido feito na identificação de novos e potenciais antigénios presentes nas células tumorais, alavancou o desenvolvimento exponencial de diversas vacinas com CDs utilizando diferentes alvos. Porém, apesar de ser uma estratégia segura e que apresenta imunogenicidade, os resultados clínicos não têm sido os esperados. Das várias razões já descritas, o tipo de antigénio, a estratégia de carregamento e o tipo de CDs podem afetar a capacidade de apresentação, interação e ativação dos linfócitos, impactando assim a capacidade citolítica dos linfócitos T. Assim, o principal objetivo deste trabalho consiste na avaliação de diferentes estratégias de carregamento das CDs e determinar qual promove maior ativação dos linfócitos T e maior resposta citotóxica quando em cultura com as células tumorais. Para tal, a expressão de diferentes antigénios foi avaliada em várias linhas tumorais, recorrendo à citometria de fluxo. Foi também avaliada a presença de marcadores pro-inflamatórios e anti-inflamatórios por RT-PCR nas linhas celulares PANC-1, MDA-MB-231, H1650 e UM-UC3. Após otimizar o tratamento com 5-aza-2’-deoxycytidine (5-AZA-Cdr) que aumenta a expressão de antigénios nas linhas celulares tumorais, foi avaliado o efeito deste tratamento na expressão dos marcadores inflamatórios e nos níveis proteicos de alguns antigénios tumorais. Na segunda parte do trabalho, foi investigada a capacidade dos linfócitos T, que estiveram em co-cultura com as CDs previamente carregadas com as diferentes fontes de antigénios, de induzirem a lise das células tumorais de forma especifica. Para isso foram utilizados dois métodos de deteção, o ensaio de libertação de lactato desidrogenase (LDH) e a citometria de fluxo (FACS). De forma a avaliar a presença de clones específicos de linfócitos T, quantificou-se a libertação de interferão (IFN)-γ após cultura com o estímulo específico. Os resultados mostraram que o 5-AZA-Cdr aumentou os níveis proteicos de cancer-testis antigens (CTAs) e marcadores inflamatórios. Relativamente aos ensaios de citotoxicidade, o FACS forneceu resultados mais específicos e sensíveis que o ensaio de libertação de LDH dado que a percentagem de clones de linfócitos T citotóxicos (CTLs) obtidos foi muito baixa, tendo em conta os resultados de libertação de IFN-γ.Resumindo, este trabalho realça a importância da seleção do tipo de antigénio tumoral para o carregamento das CDs visando uma ativação eficaz dos linfócitos, consequentemente, uma maior taxa de morte das células tumorais. Adicionalmente, o método utilizado na avaliação da morte tumoral é relevante e os resultados obtidos variam de acordo com a estratégia utilizada, devendo ser selecionados e utilizados os métodos mais sensíveis.