Characterization of different pluripotent states, the role of PSPH and GLOD4

Abstract

Despite the treatments available, cancer remains a leading cause of death worldwide. The discovery of similarities between pluripotent stem cells and cancer cells has generated interest in their use as anti-cancer vaccines. Accordingly, it has already been shown that the removal of two kinase inhibitors (2i) from the culture medium of mouse embryonic stem cells (mESCs) results in the acquisition of oncogenic characteristics. Proteomic analyses have also revealed similar expression of two proteins, Phosphoserine phosphatase (PSPH) and Glyoxalase domain-containing 4 (GLOD4), between mESCs and breast cancer cells. However, their role in stem cells is currently unknown. Although embryonic stem cells (ESCs) have been described as effective immunization agents against some types of cancer, ethical concerns arise due to their embryo origin, making induced pluripotent stem cells (iPSCs) a promising alternative. Despite the low efficiency of reprogramming somatic cells into iPSCs, several studies have reported that this efficiency could be improved through adjustments in the glycolytic and oxidative pathways. Although evidence suggests that lipid metabolism also plays a crucial role in reprogramming, little is known about the influence of dietary modifications on this process. Considering these facts, we aimed to evaluate if GLOD4 and PSPH are associated with the acquisition of oncogenic characteristics through interference with stem cells´ pluripotency pathways. Furthermore, we also intended to evaluate how cells isolated from mice subjected to different diets are sensitive to reprogramming. To assess the pluripotency state of stem cells, we used the TNG-A reporter cell line in which the levels of PSPH and GLOD4 were genetically manipulated. The sensitivity of cells isolated from adult mice subjected to different diets to reprogramming was evaluated through the levels of pluripotency genes associated with different phases of the reprogramming process. The present results showed that GLOD4 and PSPH are located in the cytoplasm and nucleus of mESCs and that their localization is maintained across the different pluripotent states. After the downregulation of GLOD4 and PSPH in the cells in the primed pluripotent state, the expression of GFP and NANOG remained unaltered, suggesting that these proteins are not involved in stem cells´ pluripotency pathways. The results obtained after reprogramming, revealed a tendency towards higher reprogramming efficiency in the younger fibroblasts, with the fibroblasts subjected to low-fat and high-fat diets presenting lower reprogramming efficiency, which may indicate that these diets pose barriers to reprogramming. By evaluating the expression of pluripotency genes, we observed differences in the sensitivity of cells from mice subjected to each of the diets. However, additional studies will be needed to understand the impact of lipid content on reprogramming. The results of this work contribute to a better knowledge of the mechanisms that regulate the pluripotency of ESCs, which may be relevant for the design of new therapeutic strategies for cancer.

Apesar dos tratamentos disponíveis, o cancro continua a ser uma das principais causas de morte no mundo. A descoberta de semelhanças entre células estaminais pluripotentes e células cancerígenas tem suscitado interesse na sua utilização como vacinas contra o cancro. Desta forma, já foi mostrado que a remoção de dois inibidores de quinases (2i) do meio de cultura de células estaminais embrionárias de murganho (mESCs) resulta na aquisição de características oncogénicas. Análises proteómicas também já revelaram a expressão semelhante de duas proteínas, Fosfoserina fosfatase (PSPH) e Glioxalase que contém o domínio 4 (GLOD4), entre as mESCs e células cancerígenas. No entanto, o seu papel nas células estaminais é desconhecido. Apesar de as células estaminais embrionárias (ESCs) terem sido descritas como agentes imunizantes eficazes contra alguns tipos de cancro, têm surgido preocupações éticas devido à sua origem embrionária, o que faz das células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) uma alternativa promissora à sua utilização. Apesar da baixa eficiência de reprogramação de células somáticas em iPSCs, diversos estudos já demonstraram que esta eficiência pode ser melhorada através de ajustes nas vias glicolíticas e oxidativas. Embora evidências sugiram que o metabolismo lipídico tem um papel crucial na reprogramação, pouco se sabe sobre a influência de modificações dietéticas neste processo. Considerando estes factos, o nosso objetivo foi avaliar se a GLOD4 e a PSPH estão associadas à aquisição de características oncogénicas através da interferência nas vias de pluripotência de células estaminais. Para além disso, pretendíamos também investigar de que forma as células expostas a diferentes dietas são sensíveis à reprogramação. Para avaliar o estado de pluripotência de células estaminais, usámos a linha celular repórter TNG-A na qual foram manipulados geneticamente os níveis de PSPH e GLOD4. A sensibilidade de células isoladas de murganhos adultos expostas a diferentes dietas à reprogramação foi avaliada através dos níveis de genes de pluripotência associados a diferentes fases do processo de reprogramação.Os resultados presentes mostraram que a GLOD4 e a PSPH estão localizadas no citoplasma e núcleo das mESCs e que essa localização se mantém nos diferentes estados de pluripotência. Após regulação negativa da GLOD4 e da PSPH nas células no estado primed, a expressão de GFP e NANOG permaneceu inalterada, sugerindo que estas proteínas não estão envolvidas nas vias de pluripotência. Os resultados obtidos após a reprogramação revelaram uma tendência para elevada eficiência de reprogramação nos fibroblastos mais jovens, com os fibroblastos adultos sujeitos a dietas com baixo e alto teor de gordura a apresentarem eficiência de reprogramação mais baixa, sugerindo que estas dietas colocam barreiras à reprogramação. Através da avaliação da expressão de genes de pluripotência observámos diferenças na sensibilidade das células provenientes de murganhos sujeitos a cada uma das dietas. No entanto, estudos adicionais serão necessários para compreender o impacto do teor lipídico na reprogramação.Os resultados deste trabalho contribuem para um melhor conhecimento acerca dos mecanismos que regulam a pluripotência das ESCs, o que pode ser relevante para o desenho de novas estratégicas terapêuticas para o cancro.