MOLECULAR CHARACTERIZATION OF CLINICAL CARBAPENEM-RESISTANT GRAM-NEGATIVE BACTERIA

Abstract

As bactérias Gram-negativas são uma das principais causas de infeções hospitalares, como pneumonia, septicémia, infeções de feridas e meningites. Estes agentes etiológicos são,muitas das vezes, resistentes a vários antibióticos, especialmente beta-lactâmicos, um fenómeno que aumentou dramaticamente constituindo atualmente uma ameaça à saúde global, particularmente, a disseminação de beta-lactamases, enzimas capazes de inativar quase todos os beta-lactâmicos, inclusivamente os carbapenemos (considerados antibióticos de 'último recurso'), tornado o tratamento destas infeções um verdadeiro desafio. Portanto, entender o perfil de resistência fenotípica e genotípica de uma população bacteriana é crucial para averiguar resistências, desenvolver e implementar políticas antibióticas, bem como melhorar as respostas de prevenção/controlo de infeções em ambientes clínicos.Este trabalho teve como objetivo caracterizar os perfis de suscetibilidade a antibióticos e o mecanismo molecular subjacente à resistência aos carbapenemos em bactérias Gram-negativas, nomeadamente vinte e quatro isolados Klebsiella spp. e dois isolados Acinetobacterspp., provenientes de doentes no Centro Hospital Universitário de Coimbra (CHUC) entre dezembro de 2022 e março de 2023. Para tal, foi feita a avaliação da suscetibilidade aos antibióticos, e as carbapenemases foram detetadas e identificadas por PCR com primersespecíficos e sequenciação de amplicões. As estirpes e a relação clonal entre os isolados foram determinados com recurso à técnica MultiLocus Sequence Typing. Finalmente, o potencial de disseminação das carbapenemases foi avaliado por ensaios de conjugação.Os resultados obtidos relativos aos isolados Klebsiella spp. demonstram que estes são, na sua maioria, de amostras de urina (58,3%; n=14) e revelaram uma elevada taxa de resistência aos carbapenemos devido à produção de carbapenemases, sendo identificadas KPC em 79,17% (n=19) e OXA-48 carbapenemases em 20,83% (n=5). Relativamente ao gene KPC foi detetada a presença das variantes KPC-3 e KPC-19. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a reportar o gene VIM num isolado Acinetobacter baumannii em Portugal, assim como a coexistência dos genes blaIMP e blaOXA-48 genes num isolado Klebsiella pneumoniae. No que diz respeito ao gene blaOXA-48 , este foi transferido com sucesso para E. coli J53 por conjugação, indicando que existe potencial de disseminação deste gene inserido em plasmídeos e a forte possibilidade de surtos provocados por isolados de Klebsiella pneumoniae produtoras de blaOXA-48. O MLST mostrou três ST diferentes: ST15, ST231 e ST13.

Gram-negative bacteria are a major cause of hospital-acquired infections, such as pneumonia, septicaemia, wound-infections and meningitis. The etiological agents are often resistant to multiple drugs, especially beta-lactams, a phenomenon that has risen dramatically and is currently defined as a global health threat, particularly, the dissemination of beta-lactamases that detain the ability to inactivate almost all beta-lactams, some of them even carbapenems (considered ‘last-resort’ antibiotics), all this narrowing the treatment options available. Therefore, understanding the phenotypic and genotypically resistance profile of a bacterial population is crucial to track resistance, develop and implement antibiotic policies, as well as improving infection prevention/ control responses in clinical settings.This work aimed to characterize the antimicrobial susceptibility profiles and the molecular mechanism underlying the resistance to carbapenems in Gram-negative bacteria, namely Klebsiella spp. and Acinetobacter spp., isolated from patients of the Centro Hospital Universitário de Coimbra (CHUC) between December 2022 and March 2023. Evaluation of antibiotic susceptibility was performed at the hospital, and carbapenemases were screened by PCR with specific primers and sequencing of amplicons. Strain types and clonal relationship between isolates were characterized using the MultiLocus Sequence Typing technique. Finally, the potential for plasmid dissemination was assessed by conjugation assays. The results obtained for the Klebsiella spp. isolates showed a prevalence of urine samples (58,3%; n=14), as well as a high rate carbapenem resistance due to carbapenemase production, being identified KPC in 79,17% (n=19) and OXA-48 carbapenemases in 20,83% (n=5). Concerning the KPC gene, the variants detected were KPC-3 and KPC-19. To our knowledge, this is the first study reporting the VIM gene in an Acinetobacter baumannii isolate in Portugal, and the first to report the co-existence of the blaIMP and blaOXA-48 genes in Klebsiella pneumoniaeisolate nationally. Regarding the blaOXA-48 gene, we can say it was successfully transferred to the E. coli J53 via conjugation, indicating that there is the potential for dissemination of theblaOXA-48 gene borne plasmid and a strong possibility of outbreaks provoked by OXA-48-positive Klebsiella pneumoniae isolates. The MLST showed three different ST: ST15, ST231 and ST13.