ENGINEERING CRISPR BASE EDITORS TO RESCUE MACHADO-JOSEPH DISEASE IN A PATIENT-DERIVED NEURONAL MODEL

Abstract

Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD), stands as the most prevalent form of autosomal dominant inherited ataxia globally. MJD is characterised as a neurodegenerative disorder with late onset, arising from an abnormal expansion of CAG repeats situated within the exon 10 of the ATXN3 gene, situated on chromosome 14q32. This results in the anomalous expansion of a polyglutamine (polyQ) tract within the Ataxin-3 protein deubiquitinase which forms toxic species and protein aggregates that culminates in neurodegeneration. Currently, there is no therapy able to modify or delay disease progression. With the emergence of iPSC models and the advent of next-generation gene-modifying enzymes like the CRISPR system, we have at our disposal extremely promising tools for the modelling and treatment of MJD. In this thesis, we aimed at engineering CRISPR-base editors to rescue Machado-Joseph disease in a novel patient-derived neuronal model of this neuropathology.Here, we report the first model of MJD patient-specific neurons based on iPSC directed neuronal differentiation. We achieved the creation of remarkably uniform neuronal cultures from gene edited MJD isogenic lines within just 7 days. Unfortunately, we faced challenges in maintaining these cultures for long-term downstream analysis. Nevertheless, our observations revealed that autophagic processes are impaired in initial stages of cultured MJD neurons.Moreover, we explored the innovative CRISPR base editor technology for precise nucleotide transition to target the ATXN3 gene and rescue MJD by two distinct strategies - induction of nonsense mutations or modulation of gene splicing - with the goal of reducing the expression of the toxic Ataxin-3 polyQ tract. We show that cytosine base editors can efficiently target and edit the endogenous ATXN3 gene in HEK293T cells, demonstrating efficient ATXN3 gene silencing or exon-skipping of the CAG-encoding exon 10. This latter translated into the reduction in Ataxin-3 full-length protein and formation of a C-terminal truncated Ataxin-3 lacking the polyQ tract. Nevertheless, the editing efficacy was limited for patient-derived iPSCs, and optimisations to further enhance it are currently under investigation.In conclusion, we have provided evidence that the direct differentiation of MJD neurons is a powerful tool in the context of disease modelling and showcased the potential of CRISPR base editors as novel therapeutic avenue for MJD treatment and other polyglutamine disorders. Overall, we believe in the capability of CRISPR-base editors for the development of personalised therapies towards clinical translation into MJD patients.

A ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é a forma mais prevalente de ataxia autossómica dominante em todo o mundo. A MJD é caracterizada como uma doença neurodegenerativa de início tardio, resultante de uma expansão anormal de repetições CAG situadas no exão 10 do gene ATXN3, localizado no cromossoma 14q32. Isso resulta na expansão anómala de uma sequência de poliglutaminas (polyQ) na proteína deubiquitinase Ataxina-3, formando espécies tóxicas e agregados proteicos que culminam em neurodegenerescência. Atualmente, não existe terapia capaz de modificar ou atrasar a progressão da doença. Com o surgimento de modelos de iPSCs e a inovação de enzimas de próxima geração de modificação genética, como o sistema CRISPR, temos à nossa disposição ferramentas extremamente promissoras para modelar e tratar a MJD. Nesta tese, tivemos como objetivo desenvolver editores de bases CRISPR para resgatar a doença de Machado-Joseph num novo modelo neuronal derivado de doentes com esta neuropatologia.Aqui, relatamos o primeiro modelo de neurónios específicos de doentes com MJD baseado na diferenciação neuronal direcionada por iPSCs. Conseguimos criar culturas neuronais bastante uniformes a partir de linhas isogénicas MJD, editadas geneticamente, em apenas 7 dias. Infelizmente, enfrentámos desafios na manutenção dessas culturas para análises a longo prazo. No entanto, as nossas observações revelaram que os processos autofágicos estão comprometidos nas fases iniciais dos neurónios MJD.Além disso, explorámos a inovadora tecnologia CRISPR base editor para edição especifica de nucleótidos visando o gene ATXN3 e resgatando a MJD por duas estratégias distintas - indução de mutações sem sentido ou modulação do splicing de genes - com o objetivo de reduzir a expressão da sequência de poliglutaminas tóxicas da Ataxina-3. Mostrámos que os editores de bases de citosina podem direcionar e editar eficientemente o gene ATXN3 endógeno em células HEK293T, demonstrando silenciamento eficiente do gene ATXN3 ou exclusão do exão 10 que codifica CAG. Isso traduziu na redução da proteína Ataxina-3 com comprimento total e na formação de uma Ataxina-3 truncada na extremidade C-terminal, sem a sequência de poliglutaminas. No entanto, a eficácia da edição foi limitada em iPSCs derivadas de doentes, e otimizações para aumentá-la ainda estão sob investigação.Em conclusão, fornecemos evidências de que a diferenciação direta de neurónios MJD é uma ferramenta poderosa no contexto de modelar doenças e demonstrámos o potencial dos editores de bases CRISPR como uma nova via terapêutica para o tratamento da MJD e outras doenças que envolvam poliglutaminas. No geral, acreditamos na capacidade dos editores de bases CRISPR para o desenvolvimento de terapias personalizadas com vista à translação clínica para doentes com MJD.