MODELING LYSOSOMAL STORAGE DISORDERS IN AN INNOVATIVE WAY: ESTABLISHMENT AND CHARACTERIZATION OF STEM CELL CULTURES FROM THE DENTAL PULP OF MUCOPOLYSACCHARIDOSES PATIENTS.

Abstract

As doenças lisossomais de sobrecarga (LSDs) são doenças raras, metabólicas e hereditárias, caracterizadas por acumulação intralisossomal de metabolitos, e principal causa na deficiência de atividade de enzimas lisossomais específicas.Estes substratos acumulados desencadeiam diversas alterações subcelulares, tornando-se tóxicos para a célula.O objetivo deste trabalho foi desenvolver e implementar um novo método para estabelecer modelos in vitro de um subgrupo de DLS, as Mucopolissacaridoses (MPS). Em geral, as MPSs são doenças multisistémicas com a nível digestivo,respiratório,visão,etc.Porém, o sistema nervoso central e o sistema esquelético, com particular envolvimento, tornaram-se alvo de maior atenção já que nenhuma terapia existente atinge eficientemente as células que o constituem, e evita a progressão dos sintomas.Frequentemente, o estudo destas doenças foca-se no uso de modelos derivados de células de doentes e, para as MPSs, a maioria dos já descritos são linhas celulares de fibroblastos ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs). Porém, ambas têm desvantagens associadas. Uma alternativa que contorne essas desvantagens é a utilização de células estaminais naturalmente presentes no organismo humano. Neste trabalho selecionamos a polpa dentária como fonte natural de células estaminais. Estas células apresentam características associadas à estaminalidade celular, como a expressão de fatores de transcrição específicos e a capacidade de autorrenovação e diferenciação noutros tipos celulares.Dado que as formas mais severas de MPS são pediátricas, uma população de células estaminais que poderia evidenciar melhor o que pretendíamos estudar são as células estaminais de dentes decíduos (SHEDs). Estas, para além da elevada taxa de proliferação e da excelente tendência de gerar células esqueléticas e cerebrais, têm a vantagem de uma recolha fácil, não requerendo uma remoção ativa do dente. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer uma metodologia de cultura celular de SHEDs obtidas a partir de doentes diagnosticados com diferentes MPS, e caracterizá-las a nível bioquímico, molecular e patofisiológicos.Para além do processo de cultura celular, utilizámos uma diversidade de técnicas moleculares,bioquímicas e imunocitoquímicas que caracterizaram as linhas celulares estabelecidas. Primeiro,estabelecemos o protocolo a partir de SHEDs de crianças saudáveis voluntárias.Logo que as culturas de SHEDs foram estabelecidas e a sua manutenção,armazenamento e passagem otimizadas, confirmou-se o potencial destas linhas celulares através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com marcadores de pluripotência específicos (Nanog, Oct3-4, Sox-2). Com resultados positivos para todos os marcadores avaliados, estendemos o apelo a crianças com MPS.Recebemos três dentes decíduos de crianças com MPS conseguindo estabelecer culturas celulares de SHEDs: duas linhas celulares de MPS II e uma de MPS VI. Estabelecidas as culturas, confirmamos serem células mesenquimais (MSCs) avaliando os níveis de expressão de vários marcadores relacionados com MSCs. Posteriormente estas células foram diferenciadas em condrócitos, osteócitos, adipócitos e neurónios. Também se verificou que todas as principais características das MPS já estão presentes nestes modelos celulares:deficiência da atividade enzimática subjacente; consequente acumulação de GAG;e presença de um padrão anormal da proteína da membrana lisossomal LAMP-1.De acordo com o que está descrito na literatura, o mesmo não se verifica com os modelos celulares de iPSCs de MPS.Assim, as vantagens globais do método são bastante óbvias: permite um estabelecimento mais rápido e barato de um modelo celular relevante para a doença; tem potencial para recapitular algumas características celulares/bioquímicas das MPS, que não conseguem ser reproduzidas em modelos de iPSCs. Em resumo, o trabalho realizado, constitui per se uma inovação total na área das DLS. Estas linhas celulares foram amplamente analisadas e todos os dados reunidos validam a sua utilização como modelo celular para estudar essas patologias em qualquer laboratório.Por último,consideramos a abordagem desenvolvida neste trabalho altamente vantajosa,já que se baseia na colheita não invasiva de amostras, seguida de um protocolo de cultura celular com elevado custo-benefício,que pode definir uma nova tendência: para investigar vias metabólicas celulares que são afetadas nas MPS;para testar novas abordagens terapêuticas in vitro.Importa referir que, o princípio aqui utilizado para MPS,pode ser replicado para praticamente qualquer DLS.

Lysosomal Storage Diseases (LSDs) are rare,metabolic, and,inherited diseases characterized by the intra-lysosomal accumulation of undegrafef metabolites,mainly due to the inefficient function of specific lysosomal enzymes.These accumulated substrates,trigger subcellular abnormalities,becoming toxic for the cell.Here we will focus one particular subgroup of LSDs:the Mucopolysaccharidoses (MPSs) and describe how we developed and implemented a novel method to model these pathologies in vitro, while extensively characterizing the generated models.MPSs are multisystemic disorders, with symptoms affecting organs as diverse as the digestive and respiratory traits, skin and eye.Two additional systems severely affected in the majority of those disorders are the skeletal and brain ones.Importantly,currently available therapies do not ameliorate brain- and skeletal-related symptoms as both these systems are among the harder ones to get access.These issues could be overcame by using cell models derived from patients cells.The cell models currently available and most commonly used to study MPSs are fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs).Still,both have their disadvantages.An alternative solution that could circumvent the existing limitations is the use of naturally-occuring stem cells.In this study,we chose as our stem cell source the dental pulp.These cells have all classical features of stem cells: expression of specific transcription factors;differentiation capacity;and self-renewal.Taking into account that the most severe forms of MPSs are pediatric,there is one particular population of stem cells in the dental pulp that can fit better in the purpose of our study Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth(SHEDs).Besides,the high proliferation rate and the great tendency to generate both skeletal and brain cells,SHEDs collection does not require the active removal of teeth,only their natural fall.Our goal in this work was to establish a method for SHEDs cell culture in house,in order to isolate cells from patients suffering form different MPS disorders and characterize them at molecular,biochemical and pathophysiology levels.Thus,besides the whole cell culture process,a diversity of molecular,biochemical and immunocytochemical assays were used to characterize the cell lines.First, we established the whole method for SHED cell culture with samples obtained from volunteer healthy children.As soon as the establishment of primary SHED cell cultures,their maintenance,storage and passage were optimized,we moved on to confirm of the stemness potential of the established SHED cell lines by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) with specific pluripotency markers.Having positive results for all the three assessed markers (Nanog, Oct3/4 and Sox2),our call for volunteers was extended to MPS children.From then on,we have received three different deciduous teeth from MPS-affected children,and succeed in establishing SHED cell cultures from all of them:two MPS II cell lines and one MPS VI.As soon as the cultures were established,we validated their mesenchymal stem cell (MSC) identity by assessing the expression levels of a number of MSC-related markers.Additionally, we have also promoted their differentiation into different cell types:chondrocytes, osteocytes, adipocytes and neurons.Furthermore,it was possible to verify that all major MPS disease hallmarks are already detectable in our currently established SHED cell models: the underlying enzymatic activity deficiency;the consequent accumulation of GAGs;and,the presence of an abnormal LAMP-1 staining pattern.The same,however,does not happen with iPSC-derived MPS cell models,as it has been extensively demonstrated in the literature.The storage phenotype,for example,is usually not visible in iPSC.Thus,the overall advantages of our model are quite obvious: allow a faster and cheaper establishment of a disease-relevant cell model; and holds potential to recapitulate some of the hallmark MPS features,which fail to be reproduced in non-differentiated iPSC models for the same disorder.Overall,the work performed,which culminated in the establishment of three MPS-derived SHED cell lines,is already a total innovation in the field.Those cells were extensively analyzed for their stemness potential,and for the presence of several disease-relevant features and all the data we gathered so far,supports the assumption that they represent a promising model to study these pathologies in any lab with standard cell culture conditions.Ultimately,we consider this an extremely advantageous approach as it relies on a non-invasive sample collection method,followed by a highly cost-effective cell culture protocol,which may actually,set a new trend not only to investigate the cellular/gene expression changes that occur in MPSs,but also to test novel therapeutic options in vitro.It is also worth mentioning that the same principle,which was used here for MPS,may virtually apply to any LSD.