Combination of drugs and genetic material in micelleplexes for osteosarcoma therapy: Physicochemical characterization and in vitro studies

Abstract

Osteosarcoma (OS) constitutes a rare and highly aggressive form of bone cancer primarily affecting children and adolescents, with an annual incidence of approximately 3.4 cases per million individuals. The compromised survival associated with OS is largely attributed to both frequent metastasis and a pronounced recurrence rate. Presently, conventional therapeutic strategies for OS encompass surgical resection and chemotherapy. However, these established approaches are associated with limited benefits due to their propensity to induce adverse effects. Consequently, there exists a necessity to develop innovative therapeutic modalities to address the limitations of existing treatments for OS. Nanosystems, such as micelleplexes, have emerged as promising vehicles for the targeted delivery of genetic material and therapeutic agents. These multifaceted carriers are generated through the conjugation of an amphiphilic copolymer with a cationic polymer, facilitating the assembly of nucleic acids by means of electrostatic interactions between the genetic material's phosphate groups and the cationic polymer's amine groups. Micelleplexes are multifunctional polymeric micelles due to their ability to encapsulate poorly water-soluble drugs within the hydrophobic inner core and nucleic acids within the positively charged hydrophilic shell at the same time, enabling a combined therapy. The main objective of this work is to prepare and physicochemically characterize micelleplexes formed by Pluronic® P105 and polyethylenimine (PEI), followed by combined incorporation of the drug methotrexate (Mtx) and miRNA. The structural characterization of the synthesized polymer P105PEI was conducted using Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) and Fourier Transform-Infrared Spectroscopy (FT-IR) analyses. Then, P105PEI polymer was loaded with Mtx by thin film and direct dissolution methods. Nanoparticles produced through the thin-film method exhibited an average size of 22 nm and a zeta potential (ZP) around 7 mV. The encapsulation efficiency (EE%) and loading capacity (LC%) were initially measured at 15.1% and 0.5%, respectively. However, employing the direct dissolution method significantly enhanced efficacy to 84% EE% and 2.7% LC%. A comparative analysis of Mtx complexation was conducted between P105PEI (30 mg/mL) and mixed micellar systems, obtained by addition of Pluronics, namely P105PEI:P105 (1:1, w/w) and P105PEI:F127 (10:1, w/w). The EE% and LC% values were influenced by the composition of the formulation and the amount of fed drug. Remarkably, the P105PEI:F127 (10:1, w/w) nanosystem exhibited the highest EE% (89.6%) and LC% (4.98%) when fed with 2 mg of Mtx. The optimized nanosystem (P105PEI:F127 (10:1, w/w)) exhibited a more controlled in vitro release profile of Mtx at pH 5.6 and 7.4, demonstrating maximal release of 60% and 73%, respectively, in contrast to the free drug (92%). Cellular uptake of Cy5-labeled siRNA was assessed for both P105PEI and P105PEI:F127 (10:1) nanosystems. The findings revealed 25% internalization at 80 nM siRNA-Cy5 concentration and 40% internalization at 50 nM for both nanosystems. The formulated nanosystems were complexed with microRNA-143 mimic at different N/P ratios within U2OS cells. However, the inconclusive nature of the results necessitates further experimentation.

O osteossarcoma (OS) constitui uma forma rara e altamente agressiva de cancro ósseo que afeta principalmente crianças e adolescentes, com uma incidência anual de aproximadamente 3,4 casos por milhão de indivíduos. A sobrevivência limitada associada ao OS é atribuída, em grande parte, à ocorrência frequente de metástases e a uma taxa de recorrência elevada. Atualmente, as estratégias terapêuticas convencionais para o OS incluem a resseção cirúrgica e a quimioterapia. No entanto, estas abordagens estabelecidas estão associadas a benefícios limitados devido à sua tendência para induzir efeitos adversos. Consequentemente, existe a necessidade de desenvolver novas alternativas terapêuticas para fazer face às limitações dos tratamentos atuais para o OS. Os nanossistemas, como os miceleplexos, têm-se mostrado veículos promissores para a entrega direcionada de material genético e medicamentos. Estes transportadores multifacetados são obtidos através da conjugação de um copolímero anfifílico com um polímero catiónico, facilitando a conjugação de ácidos nucleicos por meio de interações eletrostáticas entre os grupos fosfato do material genético e os grupos amina do polímero catiónico. Os miceleplexos são micelas poliméricas de caráter multifuncional devido à sua capacidade de encapsular simultaneamente fármacos pouco solúveis em água no núcleo interno hidrofóbico e ácidos nucleicos no revestimento hidrofílico carregado positivamente, permitindo uma terapia combinada. O principal objetivo deste trabalho é a preparação e caraterização físico-química de miceleplexos formados por Pluronic® P105 e polietilenimina (PEI), com a consequente incorporação combinada do fármaco metotrexato (Mtx) e miRNA. A caraterização estrutural do polímero sintetizado P105PEI foi realizada utilizando análises de Ressonância Magnética Nuclear de Protões (1H-NMR) e Espectroscopia de Infravermelhos com Transformada de Fourier (FT-IR). Em seguida, o polímero P105PEI foi carregado com Mtx pelo método de filme fino e de dissolução direta. As nanopartículas produzidas através do método de filme fino apresentaram um tamanho médio de 22 nm e um potencial zeta (ZP) de cerca de 7 mV. A eficiência de encapsulação (EE%) e a capacidade de carga (LC%) tinham inicialmente um valor de 15,1% e 0,5%, respetivamente. No entanto, a utilização do método de dissolução direta aumentou significativamente a eficácia para 84% EE% e 2,7% LC%. Foi efetuada uma análise comparativa entre a complexação de Mtx com P105PEI (30 mg/mL) e sistemas micelares mistos, incluindo P105PEI:P105 (1:1 p/p) e P105PEI:F127 (10:1 p/p) contendo 30 mg/mL de polímero P105PEI. Os valores de EE% e LC% foram condicionados pela composição da formulação e pela quantidade de fármaco adicionado. É de salientar que o nanosistema P105PEI:F127 (10:1 p/p) apresentou os valores mais elevados de EE% (89,6%) e LC% (4,98%) quando alimentado com 2 mg de Mtx. O nanosistema otimizado (P105PEI:F127 (10:1)) apresentou um perfil de libertação in vitro mais controlado de Mtx a pH 5,6 e 7,4, demonstrando libertações máximas de 60% e 73%, respetivamente, em contraste com o fármaco livre que atingiu 92%. A absorção celular de siRNA marcado com Cy5 foi avaliada para os nanosistemas P105PEI e P105PEI/F127 (10:1). Os resultados revelaram uma internalização de 25% a uma concentração de 80 nM de siRNA-Cy5 e uma internalização de 40% a 50 nM para ambos os nanosistemas. Os nanosistemas formulados foram complexados com o microRNA-143 mimetizador em diferentes rácios N/P nas células U2OS. No entanto, a inconsistência dos resultados exige a realização de mais ensaios.