Engineering and characterization of a mouse C2-blocking antibody: Introducing a pH-dependent target release

Abstract

ARGX-117 é um anticorpo inovador projetado para o bloqueio ótimo do componente C2 do sistema do complemento. O anticorpo terapêutico, desenvolvido pela argenx, apresenta uma libertação do alvo dependente de pH. Isto leva a que o C2 seja liberto no endossoma para degradação lisossomal, enquanto que o anticorpo viaja de volta à circulação (devido a ligação aumentada ao FcRn), livre para capturar mais moléculas de C2.No entanto, o anticorpo monoclonal não apresenta reatividade cruzada com murganho/ratinho, que é uma espécie de preferencia como modelo de doença para estudos pré-clínicos. Assim sendo, embora o ARGX-117 esteja atualmente a ser estudado para diferentes doenças, o desenvolvimento de um derivado para murganho pode permitir a investigação de novas indicações. Por esta razão, a equipa do argenx-117 desenvolveu um anticorpo bloqueador de C2 de murganho, o 12E08.Contudo, ao contrário do ARGX-117, o 12E08 não apresenta uma libertação de C2 dependente de pH, essencial pelas suas propriedades de reciclagem e aumento de semi vida.Assim, o objetivo deste projeto é desenvolver e otimizar, através da engenharia de anticorpos, um derivado do anticorpo bloqueador de C2 de murganho, que liberte o alvo de uma forma dependente do pH, para melhor imitar o modo de ação de ARGX-117.Com esse intuito, duas linhas de trabalho foram seguidas:1-mutações únicas de histidina selecionadas com base nas potenciais interações com o antigénio, tendo em conta a localização na estrutura cristalina preditiva do 12E08; 2-geração de bibliotecas combinatórias de mutações de histidina para a cadeia pesada e leves de 12E08, com uma probabilidade de prevalência de histidina de 10% em cada posição designada.Embora a introdução de mutações únicas de histidina baseadas na estrutura preditiva de 12E08 não tenha resultado em anticorpos dependentes de pH, as bibliotecas combinatórias de mutagénese de histidina provaram ser uma ferramenta poderosa para a introdução de dependência de pH. Os dados gerados revelam informações importantes sobre as potenciais posições envolvidas na introdução da característica, bem como as combinações mais promissoras para introduzir mutações. Desta forma, esta dissertação fornece indicações importantes para chegar ao desenvolvimento de um anticorpo bloqueador de C2 de murganho, dependente de pH, XIque pode ser usado para estudos in vivo mais precisos em murganho, permitindo a exploração de novas potenciais indicações.

ARGX-117 is a first in class antibody engineered for optimal blockade of the C2 component of the complement system. The therapeutic antibody, developed by argenx, features a pH dependent target release. This leads to the release of C2 in the endosome for lysosomal degradation, while the antibody travels back into circulation (thanks to an enhanced FcRn binding), free to capture more C2 molecules. However, the monoclonal antibody is not cross-reactive with mouse, a preferred species as disease model for preclinical pharmacology and safety studies. Therefore, although ARGX-117 is currently under investigation for treatment of different diseases, developing a mouse derivative might enable research for new indications. For this reason, the argenx 117 team developed a mouse C2 blocking antibody (12E08).Unlike ARGX-117, 12E08 does not show a pH-dependent target release of C2, essential for its recycling properties and longer half-life. Thus, the purpose of this project is to develop and further optimize, through antibody engineering, a derivative of the mouse C2 blocking antibody, that performs target-release in a pH-dependent manner, to better mimic ARGX-117 mode of action.To reach that goal, two lines of work were followed: 1-single histidine mutations selected based on the potential interactions with the antigen considering the location on 12E08’s predictive crystal structure; 2-generation of combinatorial histidine mutation librariesfor the heavy and light chains of 12E08, with a probability of 10% histidine prevalence in all designated positions.Although, the introduction of single histidine mutations based on the predictive structure of 12E08 did not result in pH-dependent antibodies, the combinatorial histidine mutagenesis libraries proved to be a powerful tool for introduction of a pH-dependent target release. The data generated reveals important insights about the most implicated positions in such feature as well as the most promising combinations to mutate.Therefore, this thesis provides important hints towards the development of a full pH dependent mouse C2-blocking antibody that can be used for accurate in vivo studies in mice, allowing the search for new potential indications.