INIBIÇÃO DO NRF2 COMO NOVA ABORDAGEM TERAPÊUTICA EM NEOPLASIAS LINFOIDES SENSÍVEIS E RESISTENTE AO BORTEZOMIB ESTUDO PRELIMINAR

Abstract

Durante a hematopoiese, podem ocorrer alterações nas células percussoras ou no microambiente da medula óssea o que dá origem à proliferação e acumulação de células malignas, levando ao desenvolvimento de neoplasias hematológicas. As neoplasias da célula B madura, como o linfoma difuso das grandes células B (LDGC B) e o mieloma múltiplo (MM), são um grupo bastante heterógeno de neoplasias hematológicas que resultam da transformação neoplásica das células B, nas quais o stresse oxidativo (SO) pode ter um papel fundamental na sua patogénese bem como no desenvolvimento de resistência às terapêuticas anti-cancerígenas. Vários mecanismos estão implicados no desenvolvido de resistência a fármacos, como SO, o qual resulta do desequilíbrio entre a formação das espécies reativas de oxigénio (ROS) e as defesas antioxidantes da célula, como a glutationa reduzida (GSH), e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento de neoplasias bem como na resistência fármacos anti-neoplásicos. O NRF2 (Nuclear factor erythroid2-related factor 2) é um fator de transcrição (FT) fundamental na resposta ao stresse oxidativo, sendo o principal mecanismo de resposta citoprotetora e de manutenção do estado redox. Se por um lado, o NRF2 previne a carcinogénese ao manter o equilíbrio celular em situações adversas por outro, esta capacidade protetora contribui para a progressão do cancro e desenvolvimento de resistência a terapêuticas. Além disso, este FT é regulado negativamente pelo KEAP-1, o qual é degradado na via da ubiquitina proteasoma, constituindo a inibição do proteasoma uma estratégia terapêutica já aprovada no tratamento do MM. No entanto, o desenvolvimento de resitência aos inibidores do proteasoma (IP) pode levar à falência da terapêutica. Posto isto, a inibição da atividade do NRF2 poderá constituir uma potencial estratégia terapêutica para tratar neoplasias linfoides, bem como para ultrapassar a resistência aos IP, em particular ao bortezomib, no MM. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico do brusatol, um inibidor do NRF2, em modelos in vitro de neoplasias linfoides, nomeadamente de LDGC B e MM, bem como o seu papel na resistência ao bortezomib. Para tal, as linhas celulares de neoplasias linfoides, nomeadamente de LDGC B (as células Farage) e de MM (as células H929) e resistente ao bortezomib (as células H929 BTZ) foram incubadas, durante 72 horas, na ausência e na presença de concentrações crescentes de bortezomib e de brusatol, em monoterapia, e a atividade metabólica foi determinada pelo ensaio da resazurina. As doses de brusatol que demonstraram ter maior potencial terapêutico, às 72 horas, foram selecionadas para os restantes ensaios. O tipo de morte celular foi analisado por citometria de fluxo, através da dupla marcação com Anexina-V e 7-AAD, bem como por microscopia ótica, após coloração de May-Grünwald Giemsa O ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo, utilizando a solução de iodeto de propídeo/RNase. Para avaliar o potencial da membrana mitocondrial utilizou-se a sonda JC-1 e recorreu-se à técnica de citometria de fluxo. Verificaram-se, também, os níveis de peróxidos intracelulares, de anião superóxido e de glutationa reduzida pela técnica de citometria de fluxo, em que se utilizaram as sondas DCFH2-DA, DHE e MO, respetivamente. Os resultados foram analisados tendo em consideração um nível de significância de 95% (p<0,05). Os resultados obtidos mostraram que o bortezomib reduziu a atividade metabólica em todas as linhas celulares, sendo, a linha resistente a este IP, as células H929 BTZ, , as menos sensíveis, comprovando a resistência destas células ao bortezomib. Além disso, o brusatol reduziu a atividade metabólica de forma dependente da dose, do tempo e do tipo de linha celular. De facto, a linha celular Farage revelou ser a mais sensível ao brusatol, sendo o seu IC50, às 72 horas de incubação, de 5.6 nM. Comparando o efeito do inibidor do NRF2 nas células de MM, as H929 BTZ mostraram ter uma maior sensibilidade à ação do brusatol com IC50, às 72 horas, de 16.9 nM, menor do que o IC50 das células sensíveis (H929, 26.6 nM). A análise do tipo de morte e do ciclo celular, evidenciou que o brusatol tem efeito citotóxico e citostático. A marcação com Anexina V e 7-AAD demonstrou um aumento da percentagem de células em apoptose tardia/necrose de 25% nas células H929, 8% nas células H929 BTZ e 16% nas células Farage, para as doses de brusatol mais elevadas e em comparação com o controlo. Pela técnica de microscopia ótica, observaram-se características morfológicas típicas da apoptose técnica, tais como blebbings e fragmentação nuclear, o indica que o brusatol induz morte celular, preferencialmente, por apoptose, em todas as linhas celulares. Para além disso, este fármaco induz um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1, menos significativo no caso das células Farage. Para além disso, a exposição ao brusatol resultou, de uma forma geral, numa diminuição do potencial

During hematopoiesis, may occur alterations in the precursor cells or in the bone marrow microenvironment that give rise to the proliferation and accumulation of malignant cells which leads to the development of hematological neoplasms. Mature B cell neoplasms, such as diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and multiple myeloma (MM), are a very heterogeneous group of hematological neoplasms that result of the neoplastic transformation of B cells, in which the oxidative stress may have a key role in their pathogenesis as well as in the development of resistance to anticancer therapeutics. Several mechanisms are involved in the development of dug resistance, such as oxidative stress, which results from the disequilibrium between the production of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant defenses, such as reduced glutathione (GSH), and plays a crucial role in the development of neoplasms as well as in antineoplastic drug resistence. The NRF2 (Nuclear factor erythroid2-related factor 2) is a transcription factor (TF) essential for the response to oxidative stress, being the main mechanism of cytoprotective response and responsable for the maintenance of the redox state. If on one hand, NRF2 can prevent carcinogenesis by maintaining the cellular equilibrium in adverse situations, on the other hand, this protective capacity contributes to cancer progression and the development of resistence to therapeutics. Furthermore, this TF is negatively regulated by KEAP-1, which is degradaded by the ubiquitin proteasome pathway, being the proteasome inhibition a therapeutic stratgey aproved for the treatment of MM. However, the development of resistance to proteasome inhibitors (PI) may lead to failure of the therapeutic. Therefore, the inhibition of the NRF2 activity may represent a potential therapeutic strategy for the treatment of lymphoid neoplasms, as well as to overcome the resistance to PI, in particular to bortezomib, in MM cases. Thus, the aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of brusatol, a NRF2 inhibitor, in lymphoid neoplasms in vitro models, particularly of DLBCL and MM, as well its role in bortezomib resistance. To do so, the cell lines of lymphoid neoplasms, specifically of DLBCL (Farage cell line) and of MM sensitive (H929 cell line) and resistant to bortezomib (H929 BTZ cell line), were incubated in the absence and presence of increasing concentrations of bortezomib and brusatol, for 72 hours, in monotherapy, and the metabolic activity was determined by the resazurin assay. The concentrations of brusatol which showed to have the best therapeutic potential, at 72 hours, were selected for the remaining experiments. The type of cell death was analyzed by flow cytometry, using the Annexin-V and 7-AAD double staining, as well as by optical microscopy, after smear staining according to May-Grünwald Giemsa protocol. The cell cycle was evaluated by flow cytometry, using the propidium iodide/RNAse solution. The mitochondrial membrane potential was quantified by flow cytometry, using JC-1 probe. The levels of intracellular peroxides, superoxide anion and reduced glutathione levels were also verified by flow cytometry, using DCFH2-DA, DHE and MO probes, respectively. Results were analyzed statistically considering a 95% significance level (p<0,05). The results showed that bortezomib reduced the metabolic activity in all cell lines, being the MM cells resistant to this PI, H929 BTZ cells, the least sensitive ones, which confirms the resistance of these cells to bortezomib. Moreover, brusatol reduced the metabolic activity in dose, time, and cell line dependent manner. In fact, the DLBCL cells were the most sensitive ones to brusatol, being the IC50 value, at 72 hours of incubation, 5.6 nM. By comparing the effect of the NRF2 inhibitor in the MM cells, the resistant ones were more sensitive to brusatol, being the IC50, at 72 hours, 16.9 nM, which is lower than the IC50 of the sensitive cells (26.6 nM). The cell death and cycle analysis showed that brusatol has a cytotoxic and cytostatic effect. Anneix B and 7-AAD staining demonstrated an increase in the percentage of cells in late apoptosis/necrosis of 25% in H929 cells, 8% in H929 BTZ cells and 16% in Farage cells, for the higher doses of brusatol and comparing to control. By optical microscopy were observed morphological changes typical of apoptosis, such as blebblings and nuclear fragmentation, which indicates that brusatol induces cell death, mainly, by apoptosis, in all cell lines. Moreover, this drug induces cell cycle arrest in phase G0/G1, less significant in Farage cells. Moreover, the exposure to brusatol resulted, in general, in a decrease in the mitochondrial membrane potential and the evaluation of the ROS and GSH levels showed that this drug is capable of induce increase in ROS levels and decrease in GSH levels. These results suggest that brusatol induces apoptosis by the mitochondrial pathway, being its action associate