Impacto de mutações nos genes BRCA na resposta celular à radiação ionizante

Abstract

Hereditary breast and ovarian cancer syndrome (HBOC) is an autosomal dominant disease, predominantly associated with pathogenic mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, which are involved in the maintenance of genomic stability. Individuals with HBOC have an increased predisposition to develop various types of neoplasms, primarily breast and ovarian cancers. Worldwide, breast cancer is the most common neoplasm in females and the second most deadly among cancer patients. External beam radiation therapy (EBRT) is one of the most used approaches in breast cancer treatment. The response to EBRT can be influenced by several factors, such as the presence of mutations in the BRCA1/2 genes. Furthermore, EBRT can induce several adverse effects in surrounding healthy tissues, particularly the skin.The main purpose of this project was to assess cellular radiosensitivity related to mutations in the BRCA1/2 genes, aiming to clarify the biological effects induced by exposure to ionizing radiation, not only in breast cancer patients with mutations in these genes but also in healthy individuals. Additionally, the radiosensitivity in the skin tissue was also evaluated.Thus, in this project, two human triple-negative breast cancer cell lines were used, one with a mutation in the BRCA1 gene (HCC1395) and the other without mutations in the BRCA1/2 genes (HCC1806), a human skin keratinocyte cell line (HaCaT) and three lymphoblastoid cell lines (LCLs), one from an individual carrying a BRCA1 gene mutation, another from an individual with a BRCA2 gene mutation, and another from an individual without mutations in the BRCA1/2 genes. All cell lines were exposed to 6 MV X-ray doses (0 - 10 Gy). Biological effects were assessed by evaluating cell survival, cell viability, cell death profile, cell cycle, genotoxicity, and cell migration.Following exposure to ionizing radiation, the cell survival of the HCC1806 and HaCaT cell lines decreased with the increase in exposure dose, highlighting a higher radiosensitivity of the breast cancer cell line (HCC1806). Additionally, both cell lines showed a decrease in cell viability, accompanied by an increase in cell death by early apoptosis (HCC1806 and HaCaT) and late apoptosis/necrosis (HCC1806). Even without exposure to ionizing radiation, the HCC1395 cell line revealed reduced cell viability, primarily associated with cell death by early apoptosis. Furthermore, HCC1395 cells did not show ability to form colonies. The LCLs also revealed reduced viability, which blocked the continuation of the study of ionizing radiation-induced effects. In both the non-mutated breast cancer cell line and the HaCaT cell line, a cell cycle arrest in the S phase was observed after exposure to X-ray doses. Furthermore, a G2/M cell cycle arrest was recorded in the HaCaT cell line, and an increase in the apoptotic peak was observed in the HCC1806 cell line. Exposure to ionizing radiation induced an increase in the number of binucleated cells with micronuclei in all cell lines. Also, even in the absence of irradiation, the HCC1395 cell line exhibited high genotoxicity. For all cell lines, a decrease in migration ability over time was observed, especially for higher doses. However, this decrease was not statistically significant for the HCC1395 cell line.The results obtained in this project did not allow to completely clarify the impact of mutations in the BRCA1/2 genes after exposure to ionizing radiation, however, there appears to be an influence of the presence of these mutations even when there is no exposure to ionizing radiation. Additionally, a higher radiosensitivity is noted in triple-negative breast cancer cells compared to skin keratinocyte cells, which highlights the therapeutic potential of EBRT against triple-negative breast cancer, without affecting the skin, more specifically keratinocytes.

A síndroma hereditária do cancro da mama e do ovário (HBOC) é uma doença autossómica dominante, maioritariamente associada a mutações patogénicas nos genes BRCA1 e BRCA2, genes envolvidos na manutenção da estabilidade genómica. Os indivíduos com HBOC apresentam uma predisposição aumentada para o desenvolvimento de diferentes tipos de neoplasias, principalmente cancro da mama e do ovário. Mundialmente, o cancro da mama é a neoplasia mais frequente no sexo feminino e a segunda mais mortal entre doentes oncológicos. A radioterapia de fonte externa (EBRT) consiste numa das abordagens mais usadas no tratamento do cancro da mama. A resposta ao tratamento com EBRT pode ser influenciada por variados fatores, nomeadamente pela presença de mutações nos genes BRCA1/2. Para além disso, a EBRT pode induzir diversos efeitos adversos nos tecidos saudáveis circundantes, nomeadamente na pele.O objetivo central deste projeto foi avaliar a radiossensibilidade celular associada à presença de mutações nos genes BRCA1/2, procurando clarificar os efeitos biológicos induzidos pela exposição à radiação ionizante, não só em doentes com cancro da mama com mutações nestes genes mas também em indivíduos saudáveis. Adicionalmente, procurou-se avaliar a radiossensibilidade associada ao tecido da pele.Assim, neste projeto foram utilizadas duas linhas celulares humanas de cancro da mama triplo negativo, uma com mutação no gene BRCA1 (HCC1395) e a outra sem mutação nos genes BRCA1/2 (HCC1806), uma linha celular humana de queratinócitos da pele (HaCaT) e três linhas celulares linfoblastoides (LCLs), uma de um indivíduo portador de mutação no gene BRCA1, outra de um indivíduo portador de mutação no gene BRCA2 e outra de um indivíduo não portador de mutação nos genes BRCA1/2. Todas as linhas celulares foram expostas a doses de raios-X (0 - 10 Gy) com energia de 6 MV. Os efeitos biológicos foram determinados através da avaliação da sobrevivência celular, da viabilidade e perfil de morte celular, do ciclo celular, da genotoxicidade e da migração celular.Após exposição à radiação ionizante, a sobrevivência celular das linhas celulares HCC1806 e HaCaT diminuiu com o aumento da dose de exposição, realçando uma maior radiossensibilidade da linha celular de cancro da mama (HCC1806). Adicionalmente, ambas as linhas celulares registaram uma diminuição da viabilidade celular, acompanhada por um aumento da morte celular por apoptose inicial (HCC1806 e HaCaT) e apoptose tardia/necrose (HCC1806). Mesmo sem exposição à radiação ionizante, a linha celular HCC1395 revelou uma reduzida viabilidade celular, associada maioritariamente a morte celular por apoptose inicial. Para além disso, as células HCC1395 não revelaram capacidade de formação de colónias. As LCLs também apresentaram uma reduzida viabilidade celular, o que impediu a continuidade do estudo dos efeitos induzidos pela radiação ionizante. Tanto na linha celular de cancro da mama sem mutação (HCC1806) como na linha celular HaCaT, foi observado um bloqueio do ciclo celular na fase S após exposição a doses de raios-X. Adicionalmente, foi registado um bloqueio do ciclo celular na fase G2/M na linha celular HaCaT, e um aumento do pico apoptótico na linha celular HCC1806. A exposição à radiação ionizante induziu o aumento do número de células binucleadas com micronúcleos em todas as linhas celulares. Para além disso, mesmo na ausência de irradiação, a linha celular HCC1395 demonstrou uma elevada genotoxicidade. Para todas as linhas celulares constatou-se que ocorreu uma diminuição da capacidade de migração ao longo do tempo, principalmente para doses mais elevadas. No entanto, esta diminuição não foi estatisticamente significativa para a linha celular HCC1395.A realização deste projeto não permitiu clarificar completamente o impacto de mutações nos genes BRCA1/2 após exposição à radiação ionizante, contudo, tendo em conta os resultados obtidos, parece haver influência da presença destas mutações mesmo quando não há exposição à radiação. Adicionalmente, denota-se uma maior radiossensibilidade das células de cancro da mama triplo negativo relativamente às células de queratinócitos da pele, o que realça o potencial terapêutico da EBRT contra o cancro da mama triplo negativo, sem afetar a pele, mais especificamente os queratinócitos.