Cancro da mama e substâncias naturais - avaliação da eficácia em modelos in vitro e in vivo com recurso a métodos de imagem PET

Abstract

Cancer is presently one of the biggest world health concerns, with breast cancer being the most diagnosed cancer among women. Chemotherapy stands out as one of the several therapeutic approaches used to treat cancer. However, this type of treatment is associated with the development of resistance to chemo drugs, besides several other side effects due to the indiscriminate destruction of healthy cells. Therefore, it is crucial to search for therapeutic solutions that guarantee the minimisation of side effects, while ensuring that the effectiveness of the treatment is maintained/increased.Green tea, a natural product with a high therapeutic potential, is the second most consumed beverage in the world. It contains a vast number of bioactive compounds, primarily polyphenols, with catechins being the most concentrated. The latter have antioxidant and anti-inflammatory properties, inhibit angiogenesis, induce apoptosis, and block the cell cycle. Several studies have shown the beneficial effects of combining green tea with conventional chemotherapy, not only increasing its effectiveness but also reducing adverse side effects.The primary goal of this project is to assess in vitro and in vivo the potential adjuvant effect of a green tea extract (GTEpo) when combined with clinical chemotherapy protocols for breast cancer treatment. Two cell lines from this type of malignant neoplasm were used: MCF-7 and HCC-1806. For the first cell line, the therapeutic effects of the conjugation of green tea extract with some chemotherapeutic agents, when protocol doses are reduced by 10%, were also studied. In vivo tests were performed on immunocompromised BALB/c nude (BALB/c (-)) mice, in a non-orthotopic animal model. The tumour development, as well as the effectiveness of the administered therapies, were monitored using easyPET.3D. This system is an innovative positron emission tomography (PET) technology, dedicated to small rodents. Finally, histopathological analyses were carried out for tumour samples collected during the animals' necropsies.The MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) colorimetric test, an indirect indicator of cell viability, proliferation, and cytotoxicity has been used for in vitro assessment. Regarding the MCF-7 cell line, this assay has shown that green tea extract can enhance the cytotoxic action of certain chemotherapeutic agents (for e.g. Methotrexate, Gemcitabine and Docetaxel) when administered as monotherapy, even at doses reduced by 10%. In addition, the natural compound increased the cytotoxic action of some pharmacological combinations, regardless of whether one or more chemotherapeutic agents had their concentration reduced by 10%. For the HCC-1806 cell line, it was demonstrated that green tea extract has an antineoplastic effect. When combined with other chemotherapy drugs, including Epirubicin, Cyclophosphamide, and Doxorubicin, it induces a higher level of cytotoxicity. The results obtained showed that green tea extract is a strong candidate as an adjuvant in the treatment of breast cancer, helping not only to amplify the action of several chemotherapeutic agents, but also to reduce their doses, which in turn will reduce the side effects of chemotherapy.The in vivo studies showed the unique contribution of the easyPET.3D system, as it was able to detect tumour masses even in the absence of any external evidence. In general, all the quantified mean standardized uptake values (SUVMean) are in line with the records made during the physical monitoring of the animals (weight and size of the tumour), as well as with the results of the histopathological analysis. In the MCF-7 cell line, therapy involving the administration of methotrexate (at a dose reduced by 10% compared to the clinical dose), in association with green tea extract, shows greater efficacy in tumour regression when compared to the administration of the drug alone. The same is true for the therapeutic protocol Paclitaxel (clinical protocol dose) + Gemcitabine (clinical protocol dose) + GTEpo, in the MCF-7 cell line, and Paclitaxel (clinical protocol dose) + Carboplatin (clinical protocol dose) + GTEpo, in the HCC-1806 cell line.

O cancro é, atualmente, uma das maiores preocupações a nível global no domínio da saúde, sendo o cancro da mama o mais comummente diagnosticado entre a população feminina. Diversas são as abordagens terapêuticas que tentam colmatar este grave problema, de entre as quais se destaca a quimioterapia. No entanto, este tipo de tratamento está inteiramente associado ao desenvolvimento de resistência aos quimiofármacos e a uma panóplia de efeitos colaterais, devido à destruição indiscriminada de células saudáveis. Assim, torna-se crucial a pesquisa de soluções terapêuticas que garantam a minimização dos efeitos secundários, ao mesmo tempo que asseguram a manutenção/aumento da eficácia do tratamento.O chá verde, um produto natural com um elevado potencial terapêutico, é a segunda bebida mais consumida em todo o mundo, sendo constituído por um vasto número de compostos bioativos, os polifenóis. Dentro da categoria dos polifenóis, as catequinas são as que se encontram em maior concentração neste tipo de chá. Estas possuem propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, inibem a angiogénese e induzem a apoptose e o bloqueio do ciclo celular. Vários estudos demonstram os efeitos benéficos da conjugação do chá verde à quimioterapia convencional, existindo não só um aumento da sua eficácia, como a redução dos efeitos adversos.Neste sentido, o presente projeto tem como objetivo central a avaliação in vitro e in vivo do potencial efeito adjuvante de um extrato de chá verde (GTEpo) quando aliado a protocolos clínicos utilizados na quimioterapia no tratamento do cancro da mama. Foram utilizadas duas linhas celulares deste tipo de neoplasia maligna: MCF-7 e HCC-1806. Na primeira linhagem celular, pretendeu ainda estudar-se a conjugação do extrato de chá verde a alguns agentes quimioterapêuticos com as suas doses protocoladas reduzidas em 10%. Os ensaios in vivo foram realizados em murganhos imunocomprometidos da estirpe BALB/c nude (BALB/c (-)), num modelo animal não-ortotópico. Foi utilizada uma tecnologia inovadora de tomografia por emissão de positrões (PET), dedicada a pequenos roedores – sistema easyPET.3D – para a monitorização do desenvolvimento tumoral e a avaliação da eficácia das terapêuticas administradas. Por fim, executaram-se análises histopatológicas das amostras de tumores recolhidas aquando da necropsia dos animais.Recorrendo ao ensaio colorimétrico MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), um indicador indireto da viabilidade, proliferação e citotoxicidade das células, demonstrou-se, nos ensaios in vitro da linha celular MCF-7, que o extrato de chá verde tem a capacidade de potenciar a ação citotóxica de alguns agentes quimioterapêuticos, quando testados em regime de monoterapia, mesmo com as suas doses reduzidas em 10%. Alguns exemplos são o Metotrexato, a Gemcitabina e o Docetaxel. Além disso, o composto natural aumentou a ação citotóxica de algumas combinações farmacológicas, independentemente de um ou mais agentes quimioterapêuticos ter a sua concentração reduzida em 10%. No caso da linha celular HCC-1806, comprovou-se que o extrato de chá verde exerce um efeito antineoplásico sobre este tipo de células e que, ao ser combinado com outros quimiofármacos (nomeadamente, Epirrubicina, Ciclofosfamida e Doxorrubicina), consegue aumentar-lhes o nível de citotoxicidade. Os resultados obtidos revelam que o extrato de chá verde é um forte candidato a adjuvante no tratamento do cancro da mama (nestes dois subtipos), contribuindo, não só para o incremento da ação de agentes quimioterapêuticos selecionados, como também para a redução das suas doses, o que, por sua vez, permitirá a diminuição dos efeitos secundários da quimioterapia.Nos ensaios in vivo verificou-se o ímpar contributo do sistema easyPET.3D, uma vez que foi capaz de detetar as massas tumorais, mesmo na ausência de qualquer evidência externa. De uma forma geral, todos os valores médios de captação padrão quantificados (SUVMédio) se encontram em concordância com os registos efetuados na monitorização física dos animais (peso e dimensões do tumor) e com os resultados da análise histopatológica. Na linhagem celular MCF-7, a terapêutica que envolve a administração do Metotrexato (na dose reduzida em 10% relativamente à dose clínica), em associação com o extrato de chá verde, revela uma maior eficácia na regressão tumoral, quando comparada com a administração isolada do fármaco. O mesmo se verifica para o protocolo terapêutico Paclitaxel (dose do protocolo clínico) + Gemcitabina (dose do protocolo clínico) + GTEpo, na linha celular MCF-7, e Paclitaxel (dose do protocolo clínico) + Carboplatina (dose do protocolo clínico) + GTEpo, na linha celular HCC-1806.