Estudos ex vivo de permeação de Ciclosporina A em pele usando ondas fotoacústicas

Abstract

A Dermatite Atópica (DA) é uma doença inflamatória crónica da pele, cuja prevalência tem vindo a aumentar nas últimas décadas. Estima-se que esta dermatose afeta cerca 15 a 20% das crianças em todo o mundo e 1 a 3% dos adultos. Apesar dos mecanismos exatos por trás da patogénese da DA ainda não se encontrem totalmente esclarecidos, sabe-se que esta doença da pele resulta de uma complexa interação de fatores genéticos, imunológicos e ambientais, que condicionam a disfunção da barreira da pele, a desregulação imune cutânea e a modificação da colonização da pele. Todavia, apesar de todos os esforços que têm sido feitos, a DA continua a ser uma doença para a qual ainda não existe cura tendo, por isso, o seu tratamento como objetivos principais a remissão das lesões agudas, a redução e a prevenção da sua recorrência, o alívio ou eliminação dos sintomas clínicos e fatores agravantes e o tratamento das comorbidades associadas. A abordagem de tratamento não farmacológico consiste no tratamento base de todos os doentes, contudo em casos mais graves a DA é controlada através do uso de fármacos sistémicos como imunossupressores. Contudo, e uma vez que, a maior parte dos casos de DA são leves ou moderados, é normalmente recomendado o uso de fármacos tópicos anti-inflamatórios, por forma a evitar os efeitos adversos associados ao tratamento sistémico. Os corticosteroides são classicamente os fármacos anti-inflamatórios de primeira linha usados na DA, contudo quando utilizados por longos períodos de tempo estes fármacos tendem a comprometer a barreira cutânea e apresentam riscos de eventos cutâneos adversos. Por sua vez, fármacos anti-inflamatórios que são inibidores da calcineurina permitem tratar de forma eficaz a DA sem prejudicar a barreira da pele. Assim, uma estratégia promissora para o tratamento da DA e que foi alvo de investigação no presente estudo, consiste na administração tópica de Ciclosporina A (CyA), que é uma molécula que pertence à classe dos inibidores da calcineurina. No entanto, a permeação da CyA através da pele não tem sido facilmente alcançada devido à natureza físico-química desfavorável desta molécula em termos de lipofilicidade e peso molecular, que dificulta a permeação através da camada córnea. Com o intuito de ultrapassar este problema foi utilizado um método físico desenvolvido pela LaserLeap Technologies®, denominado por Piezoporação. Este método tem como objetivo diminuir a função de barreira da camada córnea da pele ao destabilizá-la, através da utilização de ondas fotoacústicas que são geradas pela conversão eficiente da luz de um estímulo laser em gradientes de pressão através da utilização de materiais piezofotónicos. Foi testada a eficácia deste tipo de ondas utilizando uma fluência laser de 69 mJ/cm2 e uma fluência menor de 48 mJ/cm2. Uma formulação em gel contendo 2% (m/v) de CyA foi desenvolvida e a sua capacidade de libertação da molécula em estudo foi avaliada através de estudos in vitro de libertação utilizando células de difusão de Franz. Posteriormente, a permeação da CyA foi avaliada através da realização de estudos de permeação ex vivo utilizando pele de porco como membrana nas células de difusão de Franz. Para se estudar a eficácia da técnica de Piezoporação em desestabilizar a CC de forma a aumentar a sua permeabilidade, a permeação da CyA foi avaliada na presença e na ausência do método (difusão ativa versus difusão passiva). As amostras obtidas dos estudos in vitro e ex vivo foram analisadas por um método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência desenvolvido durante este estudo. Após as 0,5 horas dos estudos de permeação verificou-se que a quantidade de CyA presente no recetor foi insignificante no caso da difusão passiva. Pelo contrário, aquando da utilização das ondas fotoacústicas com diferentes fluências, quantidades superiores de CyA foram quantificadas no líquido recetor, tendo a quantidade de CyA sido maior no caso em que foi utilizada uma fluência mais elevada.

Atopic Dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease whose prevalence has increased in recent decades. It is estimated that this dermatosis affects about 15 to 20% of children and 1 to 3% of adults worldwide. Although the exact mechanisms behind the pathogenesis of AD are not yet fully understood, it is known that this skin disease results from a complex interaction of genetic, immunological and environmental factors that contribute to skin barrier dysfunction, dysregulation of the cutaneous immune system and alteration of skin colonisation. Despite all efforts, AD remains a disease for which there is currently no cure. The main goals of treatment are therefore the remission of acute lesions, the reduction and prevention of their recurrence, the alleviation or elimination of clinical symptoms and exacerbating factors, and the management of associated comorbidities. The non-pharmacological treatment approach serves as the basic treatment for all patients. Still, in more severe cases, AD is controlled by the use of systemic drugs such as immunosuppressants. Nevertheless, since most cases of AD are mild or moderate, the use of topical anti-inflammatory drugs is usually recommended to avoid the side effects associated with systemic treatment. Corticosteroids are the classic anti-inflammatory drugs of first choice used in AD. In spite of that, with prolonged use, these drugs tend to compromise the skin barrier and carry the risk of adverse cutaneous events. On the other hand, anti-inflammatory drugs that are calcineurin inhibitors allow effective treatment of AD without compromising the skin barrier. Therefore, a promising strategy for the treatment of AD, which was investigated in this study, involves the topical administration of Cyclosporine A (CyA), a molecule belonging to the class of calcineurin inhibitors. However, permeation of CyA through the skin is not easily achieved due to the unfavourable physicochemical properties of this molecule in terms of its lipophilicity and molecular weight, which hinder its penetration through the stratum corneum. To overcome this problem, a physical method developed by LaserLeap Technologies, Piezoporation, was used. This method aims to reduce the barrier function of the stratum corneum by destabilising it through the use of photoacoustic waves generated by efficiently converting laser light into pressure gradients using piezophotonic materials. The effectiveness of this type of wave was tested with a laser fluence of 69 mJ/cm2 and a lower fluence of 48 mJ/cm2. A gel formulation containing 2% (w/v) CyA was developed and the release capacity of the molecule under study was evaluated by in vitro Franz diffusion cell release studies. Subsequently, CyA permeation was evaluated by ex vivo permeation studies using pig skin as the membrane in Franz diffusion cells. To investigate the effectiveness of the Piezoporation technique in destabilising the stratum corneum to increase its permeability, the permeation of CyA was evaluated in the presence and absence of the method (active diffusion versus passive diffusion). Samples from in vitro and ex vivo studies were analysed using a High-Performance Liquid Chromatography method developed in this study. After 0.5 hours permeation studies, the amount of CyA present in the receptor was found to be insignificant with passive diffusion. Conversely, higher amounts of CyA were quantified in the receptor fluid when using photoacoustic waves with different fluences, with the amount of CyA being greater when a higher fluence was used.