Isolation and characterization of extracellular vesicles from embryogenic and non-embryogenic calli of Solanum betaceum Cav.

Abstract

A embriogénese somática (ES) é uma importante ferramenta biotecnológica para a propagação de plantas in vitro. Tem sido aplicada com sucesso em Solanum betaceum Cav., que tem sido utilizada como espécie modelo para estudar este processo em angiospérmicas lenhosas. Os fatores de stresse abiótico e os reguladores de crescimento das plantas, como as auxinas, contribuem para a indução da ES. Estes estímulos levam à desdiferenciação dos tecidos vegetais, promovendo a formação de calos. Estes podem ter diferentes capacidades embriogénicas, sendo designados por não embriogénicos (CNE) ou embriogénicos (CE). Vários fatores podem afetar a capacidade de expressar competência embriogénica, desde o genótipo e/ou a idade do CE, às condições de cultura envolvidas na indução de calos e no desenvolvimento embrionário. Neste contexto, foram estudadas diferentes vias de regulação e sinalização, com o objetivo de aprofundar o conhecimento destes mecanismos.No entanto, alguns componentes fundamentais na sinalização celular, como as vesículas extracelulares (VEs), ainda não foram explorados quanto ao seu papel na expressão da competência embriogénica. As VEs são nanoestruturas delimitadas por uma bicamada lipídica que podem ter diferentes origens, sendo geralmente classificadas pelo seu tamanho (e.g., vesículas do tipo exossómico, microvesículas). Sabe-se que as VEs estão envolvidas nas respostas das plantas a stresse biótico e possivelmente abiótico. Levantou-se a hipótese que as VEs poderão ter um papel ainda não caracterizado na ES. Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi caraterizar funcionalmente as VEs na ES em tamarilho. Para tal, foi pela primeira vez estabelecido e otimizado um protocolo para o isolamento de VEs a partir de calos de plantas. A comparação do tamanho e morfologia das VEs entre CNE e CE derivados de folhas jovens, e de CE derivado de embriões zigóticos, revelou que todas as linhas tinham VEs côncavas semelhantes a exossomas com diâmetro de ≃ 30-150 nm. Houve indícios de que o tipo de VEs produzidos pode ser afetado pela origem do calo, mas não pela sua capacidade embriogénica. Também foi possível diferenciar as VEs em frações de acordo com os seus tamanhos, utilizando o método de fracionamento por gradiente de densidade.De forma a explorar o potencial biotecnológico dos VEs produzidos por estas linhas celulares, a aplicação de quitosano como agente elicitador foi testada em CNE para aumentar a produção de VEs. No entanto, a análise dos níveis de expressão de TET8, um marcador de VEs, indicou que o tratamento com quitosano não aumentou a produção de VEs. Os níveis de expressão de TET8 também foram analisados em CNE e CE não elicitados, derivados de folhas jovens. Os resultados sugeriram que CE produz mais VEs com resposta positiva à marcação com TET8 que CNE. Isto significa que a capacidade embriogénica do calo pode influenciar os níveis de produção de diferentes subtipos de vesículas do tipo exossómico.Este trabalho foi uma das primeiras tentativas de estabelecer uma ligação entre VEs e ES. Fornece ferramentas valiosas e resultados preliminares que poderão ser úteis em estudos futuros. Será particularmente importante estudar se stresses abiótico afetam a produção de VEs em calos com diferentes capacidades embriogénicas.

Somatic embryogenesis (SE) is an important biotechnological tool for plant propagation in vitro. It has been applied with success in Solanum betaceum Cav., which has been used as a model species to study this process in tree angiosperms. Abiotic stress factors and plant growth regulators, such as auxins, both contribute to the induction of SE. These stimuli lead to the dedifferentiation of the plant tissues, which promotes the formation of calli. These can have different embryogenic capabilities, being designated as non-embryogenic (NEC) or embryogenic (EC) accordingly. Several factors can affect this ability to express embryogenic competence, from the genotype and/or age of the EC to the culture conditions involved in callus induction and embryo development. In that context different regulatory and signaling networks have been studied, aiming for a more comprehensive knowledge of such mechanisms. Nevertheless, some key players in cell signaling, such as extracellular vesicles (EVs), have not been explored for their role in the expression of embryogenic competence. EVs are lipid bilayer–enclosed nanostructures that can have different origins and can broadly be classified by their size (e.g., exosome-like vesicles, microvesicles). It has been hypothesized that EVs are involved in plant responses to biotic and, likely, abiotic stresses. Here we hypothesize that EVs might have a so far uncharacterized role in SE. In this context, the main objective of this work was to functionally characterize EVs in the process of SE in tamarillo. For that, a protocol for the isolation of EVs from plant callus was successfully established and optimized for the first time. A comparison of the size and morphology of EVs between NEC and EC derived from young leaves, and from EC derived from zygotic embryos, revealed that all lines had exosome-like cup-shaped EVs with a diameter of ≃ 30-150 nm. There were indications that the type of EVs produced may be affected by the origin of the callus, but not by its embryogenic capability. It was also possible to differentiate EVs into fractions according to their sizes, using the density gradient fractionation method.With the purpose of further exploring the biotechnological potential of the EVs produced by these cell lines, the application of chitosan as an elicitor agent was tested in NEC to increase the production of EVs. However, the analysis of expression levels of TET8, an EV marker, indicated that chitosan treatment did not increase the production of TET8-positive EVs. The expression levels of TET8 were also analyzed in NEC and EC derived from young leaves under non-elicited conditions. The results suggested that EC produces more TET8-positive EVs than NEC. This would mean that the embryogenic capability of the callus may influence the production levels of different subtypes of exome-like vesicles.This work was one of the first attempts at establishing a link between EVs and SE. It provides valuable tools and preliminary results that can be useful in further studies. It will be particularly important to study whether abiotic stress affects EVs production in calli with different embryogenic capabilities.