Characterisation of the RNA-binding protein hnRNPH2: a novel player in epileptogenesis

Abstract

A correta função do cérebro depende da organização neuronal adequada e da conectividade sináptica. Esses processos são orquestrados pela contribuição sinérgica de várias redes de proteínas. Qualquer interrupção nesses arranjos pode levar a distúrbios neurológicos. Em muitos transtornos mentais, essas questões surgem durante o neurodesenvolvimento. As doenças de neurodesenvolvimento são transtornos comportamentais e cognitivos que surgem durante o processo de maturação, caracterizados por dificuldades significativas na aquisição e execução de funções intelectuais, motoras ou sociais específicas. Curiosamente, pacientes diagnosticados com doenças mentais como o Transtorno do Espectro Autista (TEA), o Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH), o Atraso no Desenvolvimento e a Deficiência Intelectual (DD/ID) compartilham características cerebrais e fenótipos semelhantes. Os mecanismos celulares e moleculares subjacentes a esses transtornos são amplamente desconhecidos atualmente. No entanto, muitas dessas doenças mentais possuem características genéticas que podem fornecer pistas sobre a sua patogénese.Recentemente, mutações na ribonucleoproteína heterogénea H2 (hnRNP H2) foram associadas a uma doença rara de neurodesenvolvimento conhecida como Retardo Mental Sindrómico associado ao Cromossoma X tipo Bain (MRXSB). Esta síndrome apresenta uma ampla gama de características clínicas associadas a transtornos mentais, como TDAH, DD/ID, TEA, ansiedade, epilepsia ou comportamento semelhante a convulsões. A hnRNP H2 pertence à família de ribonucleoproteínas heterogéneas (hnRNPs), um grupo de proteínas de ligação de RNA (RBPs) que desempenham papéis essenciais na maturação, estabilização e transporte de RNA. Apesar da sua importância, a informação existente na literatura sobre hnRNP H2 é limitada e o papel fisiológico específico da hnRNP H2 nas células nervosas ainda é pouco compreendido.Este trabalho teve como objetivo estudar a função neuronal fisiológica da hnRNP H2. Dado o papel crucial no desenvolvimento cerebral e na plasticidade sináptica de outras hnRNPs, espera-se que a hnRNP H2 também tenha um grande impacto na sinalização neuronal. Portanto, os principais objetivos desta tese foram investigar 1) os níveis de expressão e localização da hnRNP H2 em neurónios hipocampais; 2) o papel da hnRNP H2 na morfologia neuronal; e 3) a implicação da hnRNP H2 na função neuronal.O papel da hnRNP H2 nos neurónios foi metodicamente estudado utilizando uma combinação de técnicas bioquímicas, de microscopia confocal e de super-resolução de última geração, e de eletrofisiologia. Os nossos resultados indicam um novo e inexplorado papel fisiológico da hnRNP H2 nos neurónios hipocampais. Encontrámos um aumento nos níveis de hnRNP H2 em culturas primárias de neurónios hipocampais de ratos, correlacionando-se com a maturação sináptica. Além disso, com a microscopia de super-resolução, descobrimos a presença da hnRNP H2 nas espinhas dendríticas dos neurónios hipocampais de rato, e que a hnRNP H2 é recrutada sinapticamente após a estimulação da atividade sináptica. Além disso, usando estratégias para induzir a supressão da hnRNP H2, descobrimos que esta proteína desempenha um papel na morfologia neuronal, tanto na morfologia das dendrites como nas espinhas dendríticas. Adicionalmente, descobrimos que a supressão da hnRNP H2 diminui a taxa de disparo neuronal e altera a transmissão sináptica, levantando a hipótese de que mutações nesta proteína podem estar envolvidas na epileptogénese.Resumindo, estes resultados fornecem fortes evidências de que a hnRNP H2 desempenha um papel crucial na função fisiológica dos neurónios. Contudo mais investigação será necessária. Além disso, os resultados destacam o potencial da hnRNP H2 como possível alvo de tratamento para estas doenças mentais. Esse conhecimento servirá de base para futuros projetos sobre a patogénese molecular dos transtornos relacionados com o gene HNRNPH2, facilitando o desenvolvimento de terapias direcionadas para melhorar a saúde mental e o bem-estar dos pacientes.

The proper function of the brain relies on correct neuronal organisation and synaptic connectivity. These processes are orchestrated by the synergistic contribution of several protein networks. Any disruption to these arrangements can lead to neurological disorders and impairments. In many mental disorders, these issues arise during neurodevelopment. Neurodevelopmental diseases are behavioural and cognitive disorders that arise during development, characterised by significant difficulties in the acquisition and execution of specific intellectual, motor, or social functions. Interestingly, patients diagnosed with mental illnesses such as Autism Spectrum Disorder (ASD), Attention-Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD), Developmental Delay and Intellectual Disability (DD/ID) share similar brain characteristics and phenotypes. The cellular and molecular mechanisms underlying these disorders are currently largely unknown. However, many of these mental diseases have genetic traits that can provide clues regarding their pathogenesis.Heterogeneous ribonucleoprotein H2 (hnRNP H2) mutations have recently been associated with a rare neurodevelopmental disorder known as Bain type X-linked syndromic mental retardation (MRXSB). This syndrome exhibits a wide range of clinical features linked to mental disorders such as ADHD, DD/ID, ASD, anxiety, epilepsy, or seizure-like behaviour. hnRNP H2 is a member of the heterogeneous ribonucleoprotein family (hnRNPs), a group of RNA-binding proteins (RBPs) that play essential roles in RNA maturation, stabilisation, and trafficking. Despite its significance, information about hnRNP H2 in the literature remains limited, and the specific physiological role of hnRNP H2 in neurons remains poorly understood.This work aimed to study the neuronal physiological function of hnRNP H2. Given the crucial role in brain development and synaptic plasticity of other hnRNPs, hnRNP H2 is expected to have as well a major impact in neuronal signalling. Therefore, the main goals of this thesis were to investigate 1) the expression levels and localisation of hnRNP H2 in hippocampal neurons; 2) the role of hnRNP H2 in neuronal morphology; and 3) the hnRNP H2 implication in neuronal function.The role of hnRNP H2 in neurons was methodically studied using a combination of biochemical, confocal and state-of-the-art super-resolution imaging and electrophysiology techniques. Our data indicate a novel and unexplored physiologic role for hnRNP H2 in hippocampal neurons. We found an increase in hnRNP H2 levels in primary cultures of rat hippocampal neurons that correlates with the synaptic maturation. Furthermore, with super-resolution microscopy, we discovered hnRNP H2 presence in dendritic spines of rat hippocampal neurons, and that hnRNP H2 is synaptically recruited upon synaptic activity stimulation. Besides, using knockdown hnRNP H2 strategies, we found that hnRNP H2 plays a role in neuronal morphology, both in the dendrites and spine morphology. Additionally, we found that hnRNP H2 knockdown decreases neuronal firing rate and alters synaptic transmission, thus raising the hypothesis that mutations in this protein might be involved in epileptogenesis.Together, these findings provide strong evidence that hnRNP H2 plays a crucial physiological role in neurons, prompting the need for further investigation. Additionally, the results underscore the potential of hnRNP H2 as a treatment target for these disorders. This knowledge will serve as a basis for future research on the molecular pathogenesis of HNRNPH2-related disorders, facilitating the development of targeted therapies to improve patients' mental health and well-being.