Morfogénese e organogénese em culturas in vitro de Pinus pinea L.(pinheiro-manso); Morphogenesis and organogenesis during in vitro cultures of Pinus pinea L. (Stonepine)

Abstract

Stone pine is a species with high commercial value and consequently with great economic importance. It is also a species of interest for reforestation because it promotes the rehabilitation of marginalized land, contributing to create conditions for the establishment of more demanding species. The use of stone pine in reforestation projects also has a positive impact on biodiversity conservation, as it provides habitat for endangered species. However, its propagation by conventional means presents limitations that can be minimized or even overcome by obtaining an effective micropropagation protocol. Somatic embryogenesis and organogenesis are biotechnological tools that aim at the formation of new plants from explants of plant tissues, organs or cells and have the potential to propagate clones on a large scale. Both these techniques have been studied in the last decades, but currently, an effective protocol for large-scale in vitro propagation of Pinus pinea is not yet available. Trials were carried out to attempt the induction of somatic embryogenesis in mature and immature embryonic material in MS, EDM and DCR media supplemented with different hormonal compositions. Using cotyledons of mature embryos, callus formation was obtained on DCR medium with 2.0 mg/l of 2,4-D and 0.5 mg/l of kinetin. The most promising results were obtained in the organogenesis induction trials on mature embryonic material, namely whole zygotic embryos and cotyledons. The protocol applied to cotyledons continuously cultured in DCR medium with 1.12 mg/l BAP allowed an average yield of about 135 shoots per cotyledon. The culture of cotyledons in DCR medium with 10 mg/l BAP for only 4 days, subsequently removing the hormone available in the medium, produced on average 92.6 shoots per cotyledon, but in less time and with faster development.The results obtained confirmed the potential of mature embryonic material for use in organogenesis protocols, due to the high number of adventitious shoots obtained and anticipate possible adaptations of the protocols used with a view to their optimization.

O pinheiro-manso é uma espécie com elevado valor comercial e consequentemente com grande importância económica. É também uma espécie com interesse para a reflorestação por promover a reabilitação de terrenos marginalizados contribuindo para criar condições para o estabelecimento de espécies mais exigentes. O uso do pinheiro-manso em projetos de reflorestamento tem ainda um impacto positivo na conservação da biodiversidade, uma vez que proporciona habitat para espécies ameaçadas. No entanto, a sua propagação por meios convencionais apresenta limitações passíveis de serem minimizadas ou mesmo ultrapassadas através da obtenção de um protocolo eficaz de micropropagação. A embriogénese somática e a organogénese são ferramentas biotecnológicas que visam a formação de novas plantas a partir de explantes de tecidos, órgãos ou células vegetais e que têm potencial de propagação de clones em larga escala. Ambas estas técnicas têm sido alvo de estudo nas últimas décadas, mas atualmente não se encontra ainda disponível um protocolo eficaz para a propagação in vitro de Pinus pinea em larga escala. Foram realizados ensaios de tentativa de indução de embriogénese somática em material embrionário maduro e imaturo em meio MS, EDM e DCR suplementados com diferentes composições hormonais. Com recurso a cotilédones de embriões maduros, obteve-se a formação de calos em meio DCR com 2,0 mg/l de 2,4-D e 0,5 mg/l de cinetina. Os resultados mais promissores foram obtidos nos ensaios de indução de organogénese em material embrionário maduro, nomeadamente embriões zigóticos inteiros e cotilédones. O protocolo aplicado aos cotilédones cultivados continuamente em meio DCR com 1,12 mg/l de BAP permitiu um rendimento médio de cerca de 135 rebentos por cotilédone. A cultura de cotilédones em meio DCR com 10 mg/l de BAP durante apenas 4 dias, retirando posteriormente a hormona disponível no meio, produziu em média 92,6 rebentos por cotilédone, porém em menos tempo e com desenvolvimento mais célere. Os resultados obtidos permitiram confirmar o potencial do material embrionário maduro para utilização em protocolos de organogénese, devido ao elevado número de rebentos adventícios obtidos e antever possíveis adaptações dos protocolos utilizados com vista à sua otimização.