TARPs in the regulation of M-channel function and neuronal excitability

Abstract

As correntes M são correntes de potássio dependentes de voltagem, lentas e não inativáveis, responsáveis pela regulação da excitabilidade neuronal. Disfunções nas correntes M estão associadas a epilepsia e distúrbios do desenvolvimento, e mutações nos genes que codificam as subunidades das correntes M constituem um fator de alto risco para epilepsia de início precoce, transtorno bipolar e formas leves a graves de deficiência intelectual. Os canais M mais comuns no cérebro são heterómeros Kv7.2/Kv7.3, mas canais homoméricos Kv7.2 também são encontrados em algumas regiões cerebrais e em certas localizações subcelulares. Sabendo que as correntes M desempenham um papel fundamental na regulação da excitabilidade e estão implicadas em doenças cerebrais, compreender como elas são reguladas constitui uma questão crucial que até agora foi pouco explorada.O nosso laboratório identificou um novo interator da subunidade Kv7.2 dos canais M, a Stargazina, uma proteína pertencente à família das TARPs. A Stargazina apresenta grande homologia com outras TARPs do tipo I e é um regulador bem conhecido dos receptores AMPA. Resultados obtidos anteriormente mostram que a Stargazina interage com o Kv7.2 e que regula as correntes M. Neste trabalho, estabelecemos metodologias que permitem estudar a interação entre Stargazina e Kv7.2 em células vivas e, assim, testar esta interação é regulada. Além disso, foi criado um conjunto de ferramentas moleculares para avaliar como outras proteínas da família TARP, além da Stargazina, modulam o tráfego e a função do Kv7.2.Através do uso de um ensaio de complementação de fluorescência, o ensaio splitFAST, fornecemos mais evidências da interação Stargazina-Kv7.2 e mostramos que ela é regulada pela despolarização celular e dependente da fosforilação. Além disso, desenvolvemos um conjunto de ferramentas moleculares para o estudo de todas as TARPs quanto à sua potencial interação com o Kv7.2. Utilizando as ferramentas recém-criadas mostrámos que as TARPs do tipo I impactam os níveis de expressão total e de superfície do Kv7.2.No geral, este trabalho forneceu evidências complementares da interação Stargazina-Kv7.2 e novos conhecimentos sobre como as TARPs do tipo I regulam o Kv7.2. O ensaio splitFAST que permitem visualizar a interação dentas proteínas em células vivas pode, no futuro, ser usado para estudar a regulação da interação Stargazina-Kv7.2 em neurónios vivos e fornecer informações espaciais e temporais sobre essa interação. Este estudo também abriu o caminho para estudos futuros sobre as TARPs, com o conjunto de ferramentas criado.

M-currents are slow, non-inactivating voltage-gated potassium currents, responsible for the regulation of neuronal excitability. Impairments in M-channels are associated with epilepsy and developmental disorders, and mutations in the genes encoding M-channel subunits are a high-risk factor for early-onset epilepsy, bipolar disorder, and mild to severe forms of intellectual disability. The M-channels that are most commonly found in the brain are Kv7.2/Kv7.3 heteromers, but Kv7.2 homomeric channels are also found in some brain regions and subcellular localizations. Given that M-channels play a key role in the regulation of excitability and are implicated in brain diseases, understanding how they are regulated constitutes a pivotal question that is so far underexplored. Our laboratory identified a new interactor of the Kv7.2 subunit of M-channels, Stargazin, a protein belonging to the TARP family. Stargazin shares great homology with other type I TARPs, and it is a well-described regulator of AMPA receptors. Previous data demonstrate that Stargazin interacts with Kv7.2, and that it functionally regulates M-currents. In this work we established methodologies that allow studying the interaction between Stargazin and Kv7.2 in live cells, and thus test how it is regulated, as well as created a set of molecular tools to test how the other TARP family members besides Stargazin modulate Kv7.2 traffic and function. Through the use of a fluorescence complementation assay, the splitFAST assay, we provided further proof of the Stargazin-Kv7.2 interaction and showed that it is regulated upon cellular depolarization and dependent on protein phosphorylation. Furthermore, we designed a molecular tool kit for the study of all TARPs for their potential interaction with Kv7.2. Putting the newly designed tools to use, we showed that Type I TARPs impact the cell surface ant total expression levels of Kv7.2.Overall, this work provided complementary proof of the Stargazin-Kv7.2 interaction and new knowledge on how type I TARPs regulate Kv7.2. The splitFAST live imaging assay that was established can be used to study in live neurons the regulation of the Stargazin-Kv7.2 interaction and provide spatial and temporal information on this interaction. This study also opened the door for further studies on TARPs with the set of tools created.