Understanding neuromuscular junction demise in amyotrophic lateral sclerosis using a microfluidic-based 2D-model

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease that causes muscle atrophy and loss of MNs in spinal cord and brain, eventually leading to death 3-5 years after disease diagnosis, usually due to respiratory failure. ALS is highly heterogeneous affecting 2-3 in 100,000 people, with a wide range of etiology, onset, and progression, and no cure has yet been found. There are two main forms of ALS: sporadic (no family history of ALS) and familial (due to gene mutations passed to offspring). While the vast majority of cases are sporadic, mutations in genes encoding for C9 open reading frame 72 (C9ORF72), superoxide dismutase 1 (SOD1), fused in sarcoma (FUS) and TAR DNA binding protein 43 (TDP-43) are the most common genetic causes, known as familial cases. Cytoplasmic aggregation of TDP-43 and FUS in MNs is a nearly universal feature of ALS. TDP-43 and FUS are RNA-binding proteins (RBPs) that bind thousands of RNA targets and perform critical cellular functions, such as transcription, splicing, transport, and translation of RNA. Causative mutations are thought to disrupt these fundamental processes. Loss of neuromuscular junctions (NMJs), a synapse between lower MNs and skeletal muscles, is one of the first phenotypic changes of ALS, leading to muscle denervation and, eventually, paralysis. This occurs in both patient and mouse models before axonal degeneration and MN death. Unfortunately, the mechanisms underlying NMJ loss remain unknown, and there are few strategies to combat NMJ loss. In vitro, models that mimic functional NMJs need to be developed to search for therapeutic targets. Therefore, in this work, I developed an in vitro compartmentalized microfluidic-based system that recapitulates peripheral NMJs by co-culturing C2C12 mouse skeletal muscle fibers and primary MNs. after successfully establishing a co-culture system that produces NMJs, I assessed the impact of MNs expressing humanized mutant FUS and TDP-43 on the formation of NMJs in this system. ALS related mutations in co-cultures revealed a slight trend towards the decrease of NMJs in vitro.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa que causa atrofia muscular e perda de neurónios motores na medula espinhal e no cérebro. Infelizmente não tem cura, levando à morte 3-5 anos após o início da doença, geralmente devido a insuficiência respiratória. A ELA é uma doença heterogênea que afeta 2-3 em cada 100.000 pessoas, com uma ampla gama de etiologias, início e progressão. Existem dois tipos principais de ELA: esporádica (sem histórico familiar) e familiar (devido a mutações genéticas transmitidas à descendência). Embora a grande maioria dos casos seja esporádica, mutações em genes como C9 open reading frame 72 (C9ORF72), superoxide dismutase 1 (SOD1), fused in sarcoma (FUS) e TAR DNA binding protein 43 (TDP-43) são as causas mais comuns e conhecidas de casos familiares. A agregação citoplasmática de TDP-43 e FUS em neurónios motores é uma característica quase universal da ELA. TDP-43 e FUS são proteínas de ligação ao RNA que ligam milhares de alvos de RNA e executam funções celulares críticas, como transcrição, splicing, transporte e tradução do RNA. Acredita-se que as mutações causativas da doença interrompam estes processos de grande importância. A perda das junções neuromusculares (JNM), uma sinapse entre os neurónios motores inferiores e os músculos esqueléticos, é uma das primeiras alterações fenotípicas da ELA, levando à denervação muscular e, eventualmente, à paralisia. Este fenómeno ocorre tanto em pacientes como em modelos animais de ELA, antes da degeneração axonal e morte dos neurónios motores. Infelizmente, os mecanismos subjacentes à perda das JNM permanecem desconhecidos e existem poucas estratégias para combater a sua perda. Modelos in vitro que mimetizem as funções da JNM são extremamente importantes para a procura de alvos terapêuticos. assim, neste trabalho desenvolvi um model de JNM in vitro, usando sistemas microfluidicos compartimentalizados, onde cultivei células esqueléticas de rato, e neurónimos motores primarios. Depois de estabelecer com sucesso este sistema, avaliei o impacto de neurónios motores com mutações, que expressam FUS e TDP-43 humanizado na formação de JNMs. Estas mutações revelaram um decréscimo subtil no numero de JNM estabelecidas neste modelo.