DUO THERAPEUTIC STRATEGY: SILENCING ATAXIN-3 WHILE CO-EXPRESSING A HOMOLOGOUS SEQUENCE

Abstract

As doenças de poliglutaminas (PoliQ) são classificadas como um grupo de doenças neurodegenerativas fatais causadas por uma expansão anormal citosina-adenina-guanina (CAG), que codifica uma segmento alongado de poliglutaminas na respetiva proteína. Entre estas, encontra-se a doença de Machado-Joseph (DMJ), também denominada como ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (AEC3), sendo considerada a ataxia hereditária mais prevalente em todo o mundo. A doença DMJ/AEC3 tem por base uma expansão deficiente do trinucleótido CAG no exão 10 do gene da ataxin-3 (ATXN3), que, por consequência conduz a uma anormalidade na proteína ataxina-3 (ATXN3). De modo a descobrir uma abordagem terapêutica efetiva para estes doentes, os estudos têm-se centrado essencialmente no gene mutado. No entanto, a terapia de silenciamento específica para o alelo mutante, apesar de promissora, não consegue ser abrangente para toda a população de doentes e, uma terapia que envolva o silenciamento de ambos os alelos pode levar a uma perda de função da proteína ATXN3 WT, perturbando assim a homeostase celular.De modo a responder a estes desafios, no presente estudos pretendemos desenvolver uma “estratégia terapêutica dupla”, que inclui, não só um microRNA responsável por silenciar ambos os alelos da ATXN3 humana, mas também uma sequência homóloga à ataxina-3 humana de modo a compensar as funções da proteína WT. Assim desenhamos cinco construções terapêuticas diferentes (P1-P5) e começamos por testá-las testes numa linha celular HEK 293, de forma a determinar a construção mais eficaz. Ao co-transfetar as construções terapêuticas, com cADN da ATXN3 72Q mutante humana ou com o cADN da ATXN3 27Q WT humana, observámos um silenciamento de ambas proporcional à dose. Para além disso, as construções mostraram-se eficientes em sobre expressar proteína homóloga da ATXN3 humana (ATXN3HL). Posteriormente, testámos a melhor construção (P5) num modelo que mimetiza o ambiente neuronal (linha celular Neuro2a), infetada previamente com um lentivírus que codifica a ATXN3 mutante humana (LV_ATXN3-72Q). Nesta experiência, observámos a sua capacidade de amplificar os níveis de ATXN3HL de forma proporcional à dose. De seguida, testámos a “estratégia terapêutica dupla” em murganhos C57BL/6 WT. Para o efeito, foi efetuada uma co-injeção, no estriado, de LV_ATXN3-72Q, juntamente com um vírus adeno-associado recombinante 1/2 (rAAV1/2) que codifica a construção terapêutica (rAAV1/2_5HL) no hemisfério direito, e um rAAV1/2 que expressa um microRNA que não causa silenciamento (rAAV1/2_scramble) no hemisfério esquerdo.Esta estratégia, para além de reduzir eficientemente a quantidade de agregados e ATXN3 mutante solúvel, demonstrou ainda uma sobre expressão efetiva de ATXN3HL. Em conclusão, a "estratégia terapêutica dupla" revelou ser uma abordagem promissora para o tratamento de doentes que sofrem da doença DMJ/AEC3; podendo também, no futuro, ser uma estratégia efetiva para o tratamento de outras doenças PoliQ.

Polyglutamine (PolyQ) disorders are classified as a group of fatal neurodegenerative diseases resulting from the presence of expanded cytosine-adenine-guanine (CAG) repeats, which encode for an elongated polyQ tract. Among these disorders is Machado-Joseph disease (MJD), also known as Spinocerebellar ataxia 3 (SCA3), the most prevalent dominantly inherited ataxia worldwide. MJD/SCA3 is caused by an abnormal expansion of the CAG trinucleotide in the exon 10 of ataxin-3 gene (ATXN3), leading to deficient ataxin-3 protein (ATXN3). Efforts to find a therapeutic approach for these patients have focused on targeting the flawed gene at its core. Gene silencing therapy holds promise, but specific gene targeting may not address the entire population, and targeting both alleles could lead to a loss of function in the wild-type ATXN3 protein, disrupting cellular homeostasis.To address these challenges, a “dual therapeutic strategy” was devised, consisting of a microRNA to silence both alleles of human ATXN3, and a homologous human sequence of wild-type ATXN3 to compensate its functions. We designed five different constructs and tested them in a HEK 293 cell line to determine the most effective one. Co-transfecting the therapeutic constructs with mutant human ATXN3 72Q cDNA ornwild-type human ATXN3 27Q cDNA, confirmed the non-allele specific silencing of our constructs in a dose-dependent manner. Besides that, we observed overexpression of the homologous human form of wild-type ATXN3 (ATXN3HL). After selecting the best-fitting construct, we tested it in a neuronal-like model (Neuro2a cell line) previously infected with a lentivirus encoding for mutant human ATXN3 (LV_ATXN3-72Q). The experiment confirmed its ability to induce the increase of ATXN3HL in a dose-dependent way. Thereafter, we tested our “dual therapeutic strategy” in vivo, by co-injecting LV_ATXN3-72Q along with a recombinant adeno-associated virus 1/2 (rAAV1/2), which encodes for the therapeutic construct (rAAV1/2_5HL) in the right hemisphere and encoding for a scramble microRNA (rAAV1/2_scramble) in the left hemisphere of WT C57BL/6 mice.This strategy, effectively reduced both aggregates and soluble mutant ATXN3, demonstrating target engagement, and resulted in an effective overexpression of ATXN3HL. In conclusion, the "dual therapeutic strategy" shows potential as a treatment approach, holding great promise for future clinical applications in patients suffering from MJD/SCA3 disease and other PolyQ disorders.