Neurexin and NMDAR novel interaction and co-distribution in a developmental context

Abstract

O correto alinhamento entre as membranas pré- e pós-sinápticas na sinapse é essencial para a libertação de neurotransmissores na fenda sináptica e para a ligação destas moléculas aos respetivos receptores. Estes processos são críticos para a formação, maturação e consolidação da sinapse. Este alinhamento das duas membranas é assegurado por proteínas de ambos os lados da sinapse. Exemplo disso é a interação entre a Neurexina (Nrxn), a Neuroliguina (Nlgn) e o recetor de N-metil-D-aspartato (NMDAR). Devido às suas implicações em diferentes doenças neurológicas, como a esquizofrenia e a perturbação do espetro do autismo, é considerada uma das interacções transsinápticas mais importantes em sinapses imaturas e maduras, sendo por isso o foco deste projeto. Embora estas proteínas tenham sido sempre descritas como parte de um tricomplexo, neste trabalho nós desáfiamos este modelo. Com base em resultados obtidos anteriormente que mostraram uma diminuição nos níveis de Nrxn2α em neurónios do córtex que não expressavam a subunidade GluN2B - knockout (KO) de NMDAR-GluN2B, sem alterações nos níveis de Nlgn2, questionámos a necessidade da Nlgn como uma molécula intermediária neste complexo, levando a uma possível interação exclusivamente mediada por Nrxn e NMDAR. Por este motivo, neste estudo, propomos investigar esta interação bidirecional com maior detalhe, examinando os domínios envolvidos e a co-distribuição das diferentes isoformas de Nrxn bem como as subunidades NMDAR-GluN2B e -GluN2A em neurónios em cultura de rato e murganho, durante o desenvolvimento. O nosso trabalho revelou que Nrxn1α e Nrxn3α reorganizam-se, favorecendo uma maior interação com NMDAR-GluN2A, em neurónios de córtex com 14 dias in vitro. Contrariamente, Nrxn2α não mostra preferência por nenhuma subunidade na mesma idade, exibindo, no entanto, preferência por NMDAR-GluN2B em neurónios mais maduros. Os neurónios NMDAR-GluN2B KO mostraram uma distribuição aumentada de clusters de Nrxn, sugerindo um mecanismo compensatório envolvendo as outras isoformas de Nrxn.O estudo caracteriza ainda os domínios de interação de Nrxn e NMDAR-GluN2B, confirmando a natureza extracelular da sua ligação. Curiosamente, a interação entre Nrxn e NMDAR-GluN2B demonstrou requerer a presença de sulfato de heparano, um mecanismo desconhecido até ao momento. Este resultado sugere que o sulfato de heparano regula as interações de Nrxn e permite explorar possíveis interações diretas entre Nrxn e outras proteínas, como NMDAR-GluN2B. Assim, este projeto lança um novo olhar sobre a complexa interação entre Nrxn e NMDAR-GluN2B na função e alinhamento sináptico, desafiando modelos anteriores e destacando a necessidade de mais pesquisa sobre as especificidades dessa interação, e os seus efeitos em diferentes regiões cerebrais e etapas do desenvolvimento. Os nossos resultados contribuirão para uma melhor compreensão da formação, maturação e plasticidade das sinapses, com implicações para futuros estudos que explorem alvos terapêuticos para doenças neurológicas.

The interaction between the pre- and postsynaptic membranes at the synapse is essential for the release of neurotransmitters in the synaptic cleft and the efficient binding of these molecules to the receptors on the opposite side. These processes are critical for the formation, maturation and consolidation of the synapse and require the alignment of the two opposing membranes, which is ensured by proteins on both sides of the synapse. An example of this is the interaction between Neurexin (Nrxn), Neuroligin (Nlgn) and the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR). Due to its implications in different neurological disorders such as schizophrenia (SCZ) and autism spectrum disorder (ASD), it is considered one of the most important transsynaptic interactions in immature and mature synapses and is therefore the target of this project. Although these proteins have always been described as part of a tricomplex, in this work we challenge this model. Based on our previous results showing a decrease in Nrxn2α levels in NMDAR-GluN2B knockout (KO) neurons but without changes in Nlgn2 levels, we question the need for Nlgn as an intermediate molecule in this complex, leading to a possible interaction exclusively mediated by Nrxn and NMDAR. Therefore, in this study, we propose to investigate this two-way interaction in more detail by examining the domains involved and the co-distribution of the different Nrxn isoforms and the NMDAR-GluN2B and -GluN2A subunits in rat and mouse cortical neurons, in a developmental context. Our experiments revealed that Nrxn1α and Nrxn3α reorganize in dendrites, favoring enhanced interplay with NMDAR-GluN2A, at 14 days in vitro. In contrast, Nrxn2α shows no preference for either subunit at the same early stages. At mature synapses, however, Nrxn2α exhibits a preference for NMDAR-GluN2B. Surprisingly, NMDAR-GluN2B KO neurons showed an increased distribution of Nrxn clusters, suggesting a compensatory mechanism of specific Nrxn isoforms.Furthermore, the study characterizes the interacting domains of Nrxn and NMDAR-GluN2B, confirming the extracellular nature of their connection. We show the interaction between Nrxn and NMDAR-GluN2B requires the presence of heparan sulfate. This result suggests that heparan sulfate regulates Nrxn interactions and provides insight into possible direct interactions between Nrxn and other proteins, such as NMDAR-GluN2B. Thus, this project sheds new light on the complex interplay between Nrxn and NMDAR-GluN2B in synaptic function and alignment, challenging previous models and highlighting the need for further research on the specifics of this interaction and its effects in different brain regions and developmental stages. Our results will contribute to a better understanding of synapse formation, maturation and plasticity and have implications for future studies exploring therapeutic targets for neurological diseases