The role the mitochondrial chaperone TRAP1 in the retinal pigment epithelium

Abstract

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of severe vision loss and blindness in elderly people worldwide. Vision loss caused by advanced stages of AMD has profound human and socioeconomic consequences in all societies. This degenerative disease affects the central macula (fovea) compromising central visual acuity in advanced stages, which impairs one's ability to drive, read and recognize faces. The oxidative stress-induced damage of the retinal pigment epithelium (RPE) is thought to play a key role in the onset and progression of AMD. The hallmarks of the early stages of AMD are the accumulation of macular drusen and pigmentary abnormalities. Progression to late AMD is characterized by the loss of both RPE and photoreceptor cells and abnormal proliferation of choroidal capillaries. The RPE is a monolayer of polarized and pigmented cells located between the photoreceptor cells and the choroid and plays an important role in the maintenance of the retinal homeostasis, and protection against oxidative stress, being suggested as a critical site of AMD pathology. Retinal pigment epithelial cells are particularly susceptible to oxidative stress due to exposure to intense focal light, high metabolic activity, unique phagocytic function, large oxygen gradient from the choroid, and accumulation of oxidized lipoproteins with aging. Since oxidative stress-induced RPE damage results from the excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS), produced mainly in mitochondria, mitochondrial function homeostasis is critical for maintaining ROS at physiological levels. Tumour necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1), also known as heat shock protein 75 (HSP75), is a mitochondrial molecular chaperone that supports protein folding and contributes to the maintenance of mitochondrial integrity even under cellular stress. TRAP1 protects against mitophagy, mitochondrial apoptosis and dysfunction by decreasing the production and accumulation of ROS, thus, reducing oxidative stress. Previous studies also determined that downregulation of TRAP1 expression impacts cellular function, resulting in lower mitochondrial membrane potential, increased intracellular ROS production and increased cell death. In the context of AMD, oxidative stress-induced damage to the RPE occurs due to the excessive accumulation of ROS, primarily produced in mitochondria under pathological conditions. Maintaining mitochondrial function homeostasis is crucial for keeping ROS at physiological levels and preventing the metabolic dysfunction observed in AMD pathology. Therefore, it is important to investigate proteins that are not yet related as being involved in oxidative stress mechanisms within the RPE in the context of AMD.Considering the functions of TRAP1 described in other cell types, we propose that TRAP1 modulates mitochondrial metabolism in the RPE and plays a role in preventing the onset and progression of AMD. We hypothesize that TRAP1 can mediate protection against oxidative stress in the RPE and therefore be a potential treatment target for AMD.The objective of this study was to assess the presence and function of TRAP1 in the human RPE and investigate whether TRAP1 provides protection against oxidative stress in RPE cells. To test our hypothesis, we aimed to study the cellular functions of TRAP1 in the RPE, using the Human Adult Retinal Pigment Epithelial-19 (ARPE-19) cell line as in vitro model. We also aimed to optimize and implement an experimental protocol for the differentiation of RPE cells from human induced pluripotent stem cells (iRPE) to access the presence of TRAP1. Using the ARPE-19 cell line, we evaluated the effect of TRAP1 ablation on cell viability, cell proliferation, cell mass and protein content. Then, we assessed the impact of TRAP1 loss on intracellular ROS production and superoxide anion production. Mitochondrial morphology and network were also analyzed. Moreover, the effect of TRAP1 silencing on mitochondrial respiration was determined. Finally, we have evaluated the impact of TRAP1 ablation in the localization and levels of TRAP1 upon hydrogen peroxide-induced oxidative stress. Our findings reveal that TRAP1 is expressed in human adult RPE cells and primarily localized in the mitochondria. Additionally, silencing TRAP1 expression increased ROS production in human RPE cells and led to a quiescent metabolic state. The successful establishment of the iRPE model will also allow to perform key experiments in the future, using a more complex human RPE in vitro model, that better replicates the characteristics of primary RPE. These results provide valuable insights into the development of new therapeutical strategies for AMD.

A degenerescência macular da idade (DMI) é a principal causa de perda severa de visão e de cegueira em pessoas idosas em todo o mundo. A perda de visão nas fases avançadas da DMI tem consequências profundas a nível humano e socioeconómico. Esta doença degenerativa afeta a parte central da mácula (fóvea) comprometendo a acuidade visual central em fases avançadas, impedindo os indivíduos de realizar tarefas do quotidiano, como conduzir, ler e reconhecer rostos. O dano no epitélio pigmentado da retina (RPE) induzido por stress oxidativo desempenha um papel fulcral no desenvolvimento da DMI. Nas fases iniciais, a DMI causa a acumulação de lipoproteínas oxidadas e anomalias a nível dos pigmentos. A progressão para a DMI avançada é caracterizada pela morte das células do RPE e dos fotorreceptores, além da proliferação anormal de capilares da coróide. O RPE é uma camada única de células polarizadas e pigmentadas localizada entre os fotorreceptores e a coróide e desempenha um papel importante na manutenção da homeostasia da retina e na proteção contra o stress oxidativo, sendo sugerido como um local crítico da patologia da DMI. As células do RPE são particularmente suscetíveis ao stress oxidativo devido à elevada exposição à luz, alta atividade metabólica, função fagocítica, exposição a elevado gradiente de oxigénio e acumulação de lipoproteínas oxidadas. Visto que o dano do RPE induzido pelo stress oxidativo resulta da acumulação excessiva de espécies reativas de oxigénio (ROS), produzidas principalmente na mitocôndria, a homeostasia da função mitocondrial é fundamental para manter as ROS em níveis fisiológicos. A proteína 1 associada ao recetor do fator de necrose tumoral (TRAP1), também conhecida como proteína de choque térmico 75 (HSP75), é um chaperone molecular mitocondrial que contribui para a manutenção da integridade mitocondrial, através do seu efeito antioxidante. A TRAP1 inibe a mitofagia, apoptose e disfunção mitocondrial, diminuindo a produção e acumulação de ROS e, consequentemente, reduzindo o stress oxidativo. Estudos reportados na literatura também determinaram que a redução da expressão de TRAP1 afeta a função celular, resultando numa redução do potencial de membrana mitocondrial, aumento da produção intracelular de ROS e aumento da morte celular.No contexto da DMI, o dano do RPE induzido por stress oxidativo ocorre devido à acumulação excessiva de ROS, produzidas principalmente na mitocôndria em condições patológicas. Assim, manter a homeostasia da função mitocondrial é crucial para manter as ROS em níveis fisiológicos e prevenir a disfunção metabólica observada na patologia da DMI. Portanto, é importante investigar proteínas que ainda não foram relacionadas como estando envolvidas em mecanismos de stress oxidativo no RPE no contexto da DMI.Considerando as funções da TRAP1 descritas em outros tipos de células, propomos que a TRAP1 é capaz de modular o metabolismo mitocondrial no RPE, desempenhando um papel importante na prevenção da progressão da DMI. A nossa hipótese é que a TRAP1 tem uma função protetora contra o stress oxidativo no RPE e, portanto, pode ser um potencial alvo terapêutico para a DMI.O presente estudo pretendeu avaliar a presença e função da TRAP1 no RPE humano e investigar se a TRAP1 confere proteção contra o stress oxidativo em células do RPE. Para testar a nossa hipótese, estudámos as funções celulares da TRAP1 no RPE, utilizando uma linha celular de epitélio pigmentado de retina humana adulta (ARPE-19) como modelo in vitro. Também otimizámos e implementámos um protocolo experimental para a diferenciação de células do RPE a partir de células estaminais pluripotentes induzidas humanas (iRPE) para verificar a presença de TRAP1. Utilizando a linha celular ARPE-19, avaliámos o efeito da redução de TRAP1 na viabilidade celular, proliferação celular, massa celular e conteúdo proteico. Em seguida, avaliámos o impacto da perda de TRAP1 na produção intracelular de ROS e de aniões superóxido. A morfologia e a rede mitocondrial também foram analisadas. Além disso, determinámos o efeito do silenciamento de TRAP1 na respiração mitocondrial. Por fim, avaliámos o impacto da redução de TRAP1 na localização e nos níveis de TRAP1 após a indução de stress oxidativo através de peróxido de hidrogénio.Neste estudo demonstramos que a TRAP1 é expressa nas células do RPE humano, estando localizada principalmente na mitocôndria. Além disso, o silenciamento da expressão de TRAP1 aumentou a produção de ROS em células do RPE humano e conduziu a um estado metabólico quiescente. O sucesso na implementação do modelo iRPE também permitirá a realização de experiências importantes no futuro, utilizando um modelo in vitro mais complexo e que replique melhor as características das células primárias do RPE humano. Em suma, os nossos resultados fornecem informações valiosas para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a DMI.