Astrocytic connexin 43 hemichannels activity under Alzheimer’s disease-like conditions: Regulation by adenosine A2A receptors

Abstract

Acredita-se que a doença de Alzheimer (DA), considerada como a forma mais comum de demência no idoso, seja impulsionada pela deposição de péptidos β-amiloide (Aβ) no cérebro. Perto dos depósitos de Aβ, os astrócitos parecem exibir uma remodelação morfofuncional, contribuindo para o fenótipo da DA. Evidências acumuladas sugerem uma sobrerregulação da conexina 43 (Cx43) astrocítica, a principal proteína que forma hemicanais nos astrócitos, assim como um aumento da atividade dos hemicanais astrocíticos compostos por Cx43 (Cx43 HC), em condições de DA. Nos astrócitos, os HC medeiam a libertação de gliotransmissores, nomeadamente ATP, a molécula energética que é considerada como um sinal de perigo quando fora das células. A cafeína é cada vez mais reconhecida por ter um efeito protetor contra a DA e especula-se que este efeito seja devido ao bloqueio dos recetores de adenosina A2A (A2AR) mediado pela cafeína. Uma vez que os Cx43 HC astrocíticos podem libertar ATP e os A2AR podem ser ativados por adenosina derivada do ATP, nós levantámos a hipótese de que os A2AR poderiam regular a atividade dos Cx43 HC astrocíticos. Recentemente, usando culturas primárias de astrócitos expostas a péptidos Aβ1-42 sintéticos, nós identificámos um círculo vicioso através do qual os A2AR regulam a atividade dos Cx43 HC, levando ao aumento da libertação de ATP, que é convertido em adenosina pela ecto-5’-nucleotidase (CD73), sobreativando os A2AR. No presente estudo, nós investigámos a suposta regulação da atividade dos Cx43 HC astrocíticos mediada pelos A2AR em fatias do hipocampo, que representam um sistema biológico mais integrado, onde além de astrócitos existem outras células cerebrais que estabelecem interações físicas e funcionais umas com as outras. Condições de DA foram mimetizadas através da exposição ex vivo de fatias hipocampais de murganhos a Aβ1-42 e evoluíram para modelos de DA em murganhos, nomeadamente murganhos injetados intracerebroventricularmente (icv) com Aβ1-42 recapitulando a forma esporádica da DA, e murganhos transgénicos APP/PS1 modulando a forma familiar da DA. Além disso, combinaram-se ferramentas farmacológicas e genéticas para explorar o controlo agudo ou a longo prazo da atividade dos Cx43 HC astrocíticos pelos A2AR. A permeabilização da membrana mediada pelos HC foi avaliada através da captação de brometo de etídio (EtBr), um marcador fluorescente que passa através dos HC e se acumula no núcleo das células, e para garantir que estamos a quantificar a atividade dos HC nos astrócitos nós realizámos imunohistoquímica para marcar os astrócitos para a proteína acídica fibrilar glial (GFAP), um marcador astrocítico amplamente usado. Notavelmente, este trabalho também contribuiu para estabelecer uma nova metodologia no nosso grupo, consistindo de um protocolo de processamento e análise de imagem tridimensional para quantificação da intensidade de fluorescência do EtBr por volume do núcleo dos astrócitos, providenciando assim informação mais precisa acerca da atividade dos HC nos astrócitos. Observou-se que a exposição ex vivo de fatias hipocampais de murganhos C57BL/6 a Aβ1-42 aumentou significativamente a captação de EtBr, o que indica um aumento da atividade dos HC nos astrócitos (células imuno-positivas para o GFAP), sendo este efeito prevenido pelo bloqueio dos A2AR. Em contraste, nem o bloqueio dos A2AR diretamente, nem da fonte de adenosina que ativa os A2AR, isto é, da CD73, reverteu o aumento da atividade dos HC astrocíticos no hipocampo de murganhos injetados icv com Aβ1-42 e de murganhos APP/PS1. Observou-se também que o silenciamento dos A2AR completo ou especificamente nos astrócitos, mas não especificamente nos neurónios, preveniu o aumento da atividade dos HC induzido pelo Aβ1-42 em astrócitos hipocampais, demonstrando que os A2AR astrocíticos têm um papel principal na regulação da atividade dos HC astrocíticos sob desafio com Aβ1-42. Além disso, o bloqueio dos Cx43 HC reduziu o aumento da atividade dos HC astrocíticos no hipocampo de murganhos APP/PS1 para o nível de murganhos WT, revelando que os Cx43 HC astrocíticos estão preferencialmente ativados nestes animais. Em conjunto, os nossos resultados reforçam o suposto papel dos A2AR astrocíticos na regulação da atividade dos Cx43 HC astrocíticos, previamente observado em astrócitos cultivados e aqui em astrócitos hipocampais. A demonstração de que a disrupção da atividade dos A2AR astrocíticos previne a sobreativação dos Cx43 HC astrocíticos no hipocampo de murganhos sugere que os A2AR astrocíticos são um alvo farmacológico alternativo valioso em fases precoces da DA.

Alzheimer’s disease (AD), considered as the most common form of dementia in the elderly, is believed to be driven by the deposition of amyloid-β peptides (Aβ) in the brain. Near Aβ deposits, astrocytes appear to exhibit a morphofunctional remodeling, contributing to AD phenotype. Accumulating evidences suggest an upregulation of astrocytic connexin 43 (Cx43), the major hemichannel-forming protein in astrocytes, as well as an enhancement of the activity of astrocytic Cx43 hemichannels (Cx43 HC), under AD-like conditions. In astrocytes, HC mediate the release of gliotransmitters, namely ATP, the energetic molecule that is considered as a danger signal when outside the cells. Caffeine is increasingly recognized to have a protective effect against AD and this effect is speculated to be due to caffeine-mediated blockade of adenosine A2A receptors (A2AR). Since astrocytic Cx43 HC can release ATP and the A2AR can be activated by adenosine derived from ATP, we hypothesized that A2AR might regulate astrocytic Cx43 HC activity. Recently, using primary astrocyte cultures exposed to synthetic Aβ1-42 peptides, we identified a vicious circle whereby A2AR regulate Cx43 HC activity, leading to increased ATP release, which is converted into adenosine by ecto-5’-nucleotidase (CD73), overactivating A2AR. In the present study, we investigated the putative A2AR-mediated regulation of astrocytic Cx43 HC activity in hippocampal slices, which represent a more integrated biological system, where besides astrocytes there are other brain cells that establish physical and functional interactions with each other. AD conditions were mimicked through ex vivo exposure of mouse hippocampal slices to Aβ1-42 and evolved to AD mouse models, namely mice injected intracerebroventricularly (icv) with Aβ1-42 recapitulating sporadic AD, and APP/PS1 transgenic mice modeling familial AD. Moreover, pharmacological and genetic tools were combined to explore the acute or long-term control of astrocytic Cx43 HC activity by A2AR. HC-mediated membrane permeabilization was evaluated through the uptake of ethidium bromide (EtBr), a fluorescent tracer that passes through HC and accumulates in cell nuclei, and to ensure that we are quantifying HC activity in astrocytes we performed immunohistochemistry to label astrocytes for glial fibrillary acidic protein (GFAP), a widely used astrocytic marker. Noteworthy, this work also contributed to establish a novel methodology in our group, consisting of a three-dimensional image processing and analysis protocol for quantification of EtBr fluorescence intensity per astrocyte nucleus volume, thus providing more accurate information about HC activity in astrocytes. It was observed that ex vivo exposure of hippocampal slices from C57BL/6 mice to Aβ1-42 significantly increased EtBr uptake, which indicates an enhancement of HC activity in astrocytes (GFAP immuno-positive cells), being this effect prevented by A2AR blockade. In contrast, neither blocking A2AR directly nor the source of adenosine that activates A2AR, that is, CD73, reversed the increased astrocytic HC activity in the hippocampus of icv-Aβ1-42-injected mice and APP/PS1 mice. It was also observed that full or astrocyte-specific, but not neuron-specific, A2AR silencing prevented Aβ1-42-induced increase in HC activity in hippocampal astrocytes, demonstrating that astrocytic A2AR have a major role in the regulation of astrocytic HC activity upon Aβ1-42 challenge. Furthermore, Cx43 HC blockade reduced the increased astrocytic HC activity in the hippocampus of APP/PS1 mice to the level of WT mice, revealing that astrocytic Cx43 HC are preferentially activated in these animals. Overall, our results strengthen the putative role of astrocytic A2AR in the regulation of astrocytic Cx43 HC activity, previously observed in cultured astrocytes and here in hippocampal astrocytes. The demonstration that the disruption of astrocytic A2AR activity prevents astrocytic Cx43 HC overactivation in the mouse hippocampus suggests that astrocytic A2AR are an alternative valuable pharmacological target at early stages of AD.