Extrato de chá verde no cancro da mama - da análise cromatográfica aos modelos in vitro, in vivo e imagem PET

Abstract

Hoje em dia, o cancro representa uma das principais causas de morte em todo o mundo. Segundo as projeções para o ano de 2040, esperam-se cerca de 16,3 milhões de óbitos devido a esta patologia em ambos os sexos a nível mundial. O cancro da mama é uma das principais causas de morte nas mulheres, estimando-se que em 2040 irão surgir 3,19 milhões de novos casos com cerca de 1,04 milhões de óbitos em mulheres devido a esta doença. As terapêuticas convencionais utilizadas no tratamento do cancro correspondem a: intervenção cirúrgica, radioterapia, quimioterapia e imunoterapia. Apesar de maioritariamente eficazes, estas técnicas convencionais apresentam algumas desvantagens, destacando-se como principal, os efeitos secundários indesejados provocados principalmente pelos agentes quimioterapêuticos. É, deste modo, extremamente importante a investigação de alternativas terapêuticas, que sejam eficazes e que permitam reduzir estes efeitos secundários. A bebida mais consumida no mundo, depois da água, é o chá. O chá é composto por uma mistura de polifenóis, flavonóides e vitaminas. O chá verde, em específico, é rico em catequinas, que apresentam uma potente ação antioxidante. São capazes de prevenir a formação de radicais livres que podem lesar as células e, até mesmo, conduzir à sua morte. Neste contexto, formulou-se a hipótese de que a ingestão de chá verde poderia reduzir o risco de desenvolvimento de cancro e até ajudar a realizar um tratamento mais eficaz e rápido, diminuindoos efeitos secundários dos agentes terapêuticos.O presente projeto teve como principais objetivos identificar os principais componentes presentes num extrato de chá verde em pó (GTEp) com recurso às técnicas de HPLC e TLC; avaliar, in vitro, a ação citotóxica do GTEp numa linha celular de cancro da mama (MCF-7); averiguar se o GTEp, em concentrações determinadas, conseguiria potenciar o efeito citotóxico dos fármacos selecionados (a partir de protocolos da clínica) nesta linha celular. Pretendia determinar-se, portanto, qual(ais) desta(s) concentração(ões) de GTEp seria(m) a(s) melhore(s), tanto em regime de monoterapia como em combinação com esses fármacos. Com base nos estudos in vitro, foram realizados estudos in vivo em murganhos imunocomprometidos BALB/c (-) fêmeas, para monitorizar a evolução de tumores induzidos (modelo não-ortotópico) com a referida linha celular e a eficácia da administração de GTEp isolado e em conjunto com os fármacos escolhidos. Para esta monitorização efetuou-se a medição das dimensões do tumor e a pesagem de animal e a avaliação imagiológica, por tomografia de emissão de positrões (PET). O sistema inovador utilizado – sistema easyPET.3D – é dedicado a animais de pequeno porte e o radiofármaco usado foi o 18F-FDG. Foram ainda realizados estudos histológicos dos tumores após a necrópsia dos animais.Nos ensaios in vitro, através de um teste de viabilidade celular (MTT), foi possível comprovar que este extrato de chá verde (GTEp), quando foi administrado isoladamente, possui efeito citotóxico sobre a linha celular MCF-7, destacando-se em especial a ação do GTEp na concentração de 5 µg/ml. O uso do GTEp potenciou o efeito citotóxico de alguns agentes quimoterapêuticos estudados. Destacam-se os protocolos usando 5-Fluorouracilo, Doxorrubicina, Epirrubicina, Paclitaxel e Docetaxel, principais casos onde a combinação com o GTEp foi mais benéfica, maioritariamente nas concentrações de 0,5 e 5 µg/ml. O GTEp mostra-se, assim, um agente promissor como adjuvante no tratamento do cancro da mama e, eventualmente, poderá permitir reduzir a(s) dose(s) administrada(s) destes fármacos na clínica ou o número de ciclos terapêuticos.Nos ensaios in vivo, o sistema easyPET.3D, revelou-se extremamente eficaz, uma vez que permitiu a identificação do tumor mesmo antes deste ser visível a olho nu. As dimensões dos tumores foram diminuindo ao longo do tratamento administrado, sendo que num dos casos deixou de ser possível observá-lo a olho nu (externamente). Os valores de SUVmédio também foram diminuindo, o que demonstra uma redução da sua atividade metabólica, permitindo deduzir a eficácia da terapêutica escolhida. Como perspetivas de desenvolvimento futuro sugere-se que uma amostra de GTEp seja analisada por espetrometria de massa para confirmar com mais exatidão os resultados obtidos por HPLC e TLC o aumento da robustez estatística, através da realização de novos ensaios de MTT e o estudo do possível efeito isolado do GTEp sobre uma linha celular normal de mama. Será também interessante executar ensaios de citometria de fluxo e de sulforodamina B para se comprovarem os resultados obtidos in vitro.Quanto aos ensaios in vivo, é extremamente importante o aumento do número de animais em estudo, de forma que cada grupo seja constituído por animais submetidos às terapêuticas clínicas selecionadas isoladas e com a respetiva associação ao GTEp. Quanto aos estudoss imagiológicos por tecnologia PET, destaca-se o interesse da associação da

Nowadays, cancer is one of the leading causes of death worldwide. According to projections for the year 2040, around 16.3 million deaths are expected due to this pathology in both sexes worldwide. Breast cancer is one of the main causes of death in women, being estimated that in 2040 there will be 3.19 million new cases ,with about 1.04 million deaths in women due to this disease. The conventional therapies used in the treatment of cancer are surgery, radiotherapy, chemotherapy and immunotherapy. Although mostly effective, these conventional techniques have some disadvantages, the main one being the unwanted side effects caused mainly by chemotherapeutic agents. It is, therefore, extremely important to investigate therapeutic alternatives that are effective and allow to reduce these side effects. The most consumed beverage in the world, after water, is tea. Tea is a mixture of polyphenols, flavonoids and vitamins. Green tea is rich in catechins, which have a potent antioxidant action. They can prevent the formation of free radicals that can damage cells and even lead to their death. In this context, it was hypothesized that the intake of green tea could reduce the risk of developing cancer and even help to carry out a more effective and faster treatment, reducing the side effects of therapeutic agents. The main aims of this project were to identify the main components present in a powdered green tea extract (GTEp) using HPLC and TLC; to evaluate, in vitro, the cytotoxic action of GTEp in a breast cancer cell line (MCF-7); to verify whether the GTEp, at certain concentrations, would be able to potentiate the cytotoxic effect of the selected drugs (based upon clinical protocols) in this cell line. Therefore, it was intended to determine which of these GTEp concentration(s) would be the best(s), both in monotherapy regimen and in combination with these drugs. Based upon in vitro studies, in vivo studies were carried out in immunocompromised female BALB/c (-) mice, to monitor the evolution of induced tumors (non-orthotopic model) with the referred cell line and the efficacy of administration of GTEp alone and together with the chosen drugs. For this monitoring, the tumor dimensions were measured, the animal was weighed, and images were acquired using positron emission tomography (PET). The innovative system used – easyPET.3D system – is dedicated to small animals and the radiopharmaceutical used was 18F-FDG. Histological studies of the tumors were also performed after the necropsy of the animals. In in vitro assays, through a cell viability test (MTT), it was possible to prove that this green tea extract (GTEp), when administered alone, has a cytotoxic effect on the MCF-7 cell line, standing out the action of GTEp at a concentration of 5 µg/ml. The use of GTEp potentiated the cytotoxic effect of some studied chemotherapeutic agents. Protocols using 5-Fluorouracil, Doxorubicin, Epirubicin, Paclitaxel and Docetaxel stand out, the main cases where the combination with GTEp was more beneficial, mostly at concentrations of 0.5 and 5 µg/ml. Thus, GTEp is a promising agent as an adjuvant in the treatment of breast cancer and, eventually, it may allow reducing the dose(s) of these drugs administered in the clinic or the number of therapeutic cycles. In the in vivo tests, the easyPET.3D system proved to be extremely effective, as it allowed the identification of the tumor even before it was visible to the naked eye. The dimensions of the tumors decreased over the course of the administered treatment, and in one case it was no longer possible to observe it with the naked eye (externally). The average SUV values also decreased, which demonstrates a reduction in its metabolic activity, allowing to deduce the effectiveness of the chosen therapy. As prospects for future development, it is suggested that a sample of GTEp be analyzed by mass spectrometry to more accurately confirm the results obtained by HPLC and TLC, increase statistical robustness, by carrying out new MTT assays and studying the possible isolated effect of GTEp on a normal breast cell line. It will also be interesting to perform flow cytometry and sulforhodamine B assays to confirm the results obtained in vitro. As for the in vivo assays, it is extremely important to increase the number of animals under study, so that each group has animals submitted to isolated clinical therapies selected and with the respective association with the GTEp. As for imaging studies using PET technology, the interest in associating computed tomography with the easyPET.3D system stands out, to allow the identification of anatomical structures in a more efficient way. This knowledge is essential to improve the accuracy of defining ROIs, which is conditioned by morphological changes due to tumor development. Finally, to minimize the side effects of i.p. anesthesia, the use of gaseous anesthesiology is proposed, reducing, simultaneously and considerably, the recovery time and