Influence of ApoE4 on mitochondrial-related transcriptional activity and function in Alzheimer's disease cellular models

Abstract

O alelo ε4 do gene APOE (ApoE4) é o principal fator de risco genético para a doença de Alzheimer (DA) esporádica, estando presente em 40-65% de todos os doentes. A ApoE4 tem sido associada a vários processos patológicos, possivelmente ligados ao declínio cognitivo, incluindo as patologias do péptido β-amilóide e da proteína tau. No entanto, o mecanismo que justifica o impacto da ApoE4 na progressão da DA ainda não é totalmente conhecido, não existindo atualmente estratégias terapêuticas eficazes para esta doença neurodegenerativa altamente debilitante. A ApoE4 interage com a mitocôndria, causando a sua disfunção e neurotoxicidade, associada ao aumento dos níveis de Ca2+ e de espécies reativas de oxigénio, e perturbando a dinâmica mitocondrial, nomeadamente os processos de fusão, fissão e mitofagia. Além disso, a ApoE4 sofre translocação para o núcleo, regulando a expressão de genes envolvidos no envelhecimento, produção do péptido β-amilóide, inflamação e apoptose, potencialmente associados à patogénese da DA. Com base nestes dados, foi sugerida a hipótese de que, para além da interação direta com este organelo, a ApoE4 afeta a sua função e dinâmica através da alteração da expressão de proteínas mitocondriais. Assim, este estudo teve como objetivo investigar a translocação da ApoE4 para o núcleo e o seu impacto na expressão de genes relacionados com a mitocôndria, codificados polo DNA nuclear, e, possivelmente, associados a alterações na função e morfologia mitocondriais.De forma a atingir estes objetivos, utilizaram-se diferentes modelos celulares para a DA, nomeadamente culturas primárias de neurónios corticais de rato Wistar expostas a oligómeros Aβ1-42 (AβO), culturas primárias de neurónios corticais obtidas de embriões do murganho transgénico APP/PS1 vs WT, e linhas celulares de murganho Neuro2a(N2a)-APPSwe vs N2a-WT. As células foram transfetadas com o plasmídeo que codifica a ApoE4-GFP ou ApoE3-GFP. Os resultados mostraram que a ApoE4 está presente no núcleo e na mitocôndria de todos os modelos celulares. Em comparação com os níveis de ApoE3 e na condição basal, ambas as culturas primárias de neurónios apresentaram um aumento nos níveis de ApoE4 no núcleo, e os neurónios derivados de rato Wistar também exibiram esta variação nos níveis mitocondriais. Em contraste, as células N2a-APPSwe revelaram uma diminuição dos niveis de ApoE4 em ambos os organelos. A expressão da ApoE4 não alterou a atividade metabólica das linhas celulares N2a, apesar de se ter observado um aumento nos níveis de caspase 3 ativa nas células N2a-WT. Também se observou uma diminuição dos níveis de mRNA para a sirtuína 3 (SIRT3) em ambas as linhas celulares, N2a-WT e N2a-APPSwe, e de mRNA para o PGC- 1⍺ nas células N2a-WT. No contexto da função mitocondrial, observou-se uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial (Δψm) nas células N2a-APPSwe e neurónios de ratinho APP/PS1, mas este parâmetro não foi afetado pela expressão da ApoE4. Também não foram detetadas alterações significativas nos níveis de Ca2+ nas linhas celulares N2a. No entanto, a expressão da ApoE4 mostrou estar associada a alterações significativas da morfologia mitocondrial. Em particular, comparando com as células que expressam ApoE3, a expressão de ApoE4 pelos neurónios derivados de rato Wistar (condição basal) revelaram um aumento significativo na circularidade mitocondrial, enquanto os neurónios obtidos de ratinhos APP/PS1 e as células N2a-WT apresentaram uma diminuição significativa da conetividade mitocondrial, sugerindo uma perturbação da integridade mitocondrial.Este estudo contribuiu para a compreensão de efeitos potencialmente patogénicos da expressão ApoE4, relacionados com a mitocôndria, tanto em condições basais e como no contexto da DA. Os resultados obtidos revelam potenciais mecanismos moleculares subjacentes ao elevado risco de desenvolver DA, assim como possíveis alvos terapêuticos afetados pela ApoE4. Em particular, a modulação da expressão génica e efeitos neuroprotetores contra alterações da morfologia mitocondrial poderão desempenhar um papel importante com vista a atenuar processos patológicos da DA associados à expressão de ApoE4.

ApoE4 (APOE ε4 allele) is the primary genetic risk factor for sporadic Alzheimer’s disease (AD), being found in 40-65% of all AD patients. ApoE4 has been associated to many pathological processes possibly linked to cognitive impairment, like amyloid-β (Aβ) and tau pathologies. However, the exact mechanism underlying ApoE4 impact on AD progression is unclear and no directed and effective therapies are available for this highly debilitating neurodegenerative disorder. ApoE4 interacts with mitochondria, causing mitochondrial dysfunction and neurotoxicity, associated with increased mitochondrial Ca2+ and reactive oxygen species (ROS) levels, and it also affects mitochondrial dynamics, namely fusion, fission and mitophagy. ApoE4 translocates to the nucleus too, regulating the expression of genes involved in aging, Aβ production, inflammation and apoptosis, potentially linked to AD pathogenesis. Based on these findings, we hypothesized that, apart from direct organelle interaction, ApoE4 affects mitochondrial function and morphology by interfering with the expression of mitochondrial proteins through modified transcription. Thus, we aimed to investigate ApoE4-mediated nuclear translocation and its impact on nuclear-encoded mitochondrial gene expression, possibly related to changes in mitochondrial function and morphology.To achieve this aim, different AD cell models were used, namely Wistar rat primary cortical neurons exposed to Aβ1-42 oligomers (AβO), primary cortical neurons from APP/PS1 transgenic vs WT mouse embryos, and mouse Neuro2a (N2a)-APPSwe vs N2a-WT cell lines. Cells were transfected with plasmid-encoded ApoE4-GFP or ApoE3- GFP. The results showed that ApoE4 is present in the nucleus and mitochondria in AD and WT cell models. Comparing to ApoE3, both rat and mouse WT primary neuronal cultures presented increased ApoE4 levels in the nucleus. An increase in ApoE4 in mitochondria was also observed in Wistar rat primary neurons (under basal condition). In contrast, N2a-APPSwe cells revealed decreased ApoE4 levels in both organelles. ApoE4 expression did not affect N2a metabolic activity, although it slightly increased the levels of active caspase-3 in N2a-WT cells. Interestingly, decreased mRNA levels of sirtuin 3 (SIRT3) in both N2a-WT and N2a-APPSwe cells, and peroxisome proliferator- activated receptor-gamma coactivator-1a (PGC-1⍺) in N2a-WT cells were also associated to ApoE4. In the context of mitochondrial function, a decrease in mitochondrial membrane potential (Δψm) was observed in AD mutant cell line and mouse neurons, but this parameter was not affected by ApoE4 expression. No changes in mitochondrial Ca2+ levels were observed in N2a cell lines either. However, ApoE4 expression was associated to alterations in mitochondrial morphology, in WT rat neurons, APP/PS1 mouse neurons and N2a-WT cells. In particular, comparing to ApoE3- expressing cells, rat primary neurons (basal condition) showed a significantly increase in mitochondrial circularity, and APP/PS1 mice primary neurons and N2a-WT cells revealed a significant decrease in mitochondrial connectivity, suggesting an impairment in mitochondrial integrity.This study provides insights into ApoE4-mediated mitochondrial-related effects, that are potentially pathogenic, both in non-AD and AD cell models. Data uncovers potential molecular mechanisms underlying the increased risk to develop AD as well as potential therapeutic targets affected by ApoE4. In particular, modulation of gene expression and neuroprotective effects against mitochondrial morphological impairments might play a major role in alleviating AD pathological features associated with the expression of ApoE4.