Glutaminolysis inhibition, in monotherapy and in combination with epigenetic modulators and ibrutinib, on chronic lymphocytic leukemia

Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in Western countries, characterized by the clonal expansion of B lymphocytes. There are still several challenges in CLL therapy, such as toxicity profiles in elderly patients.Metabolic reprogramming consists of changes in tumor cells’ metabolism to sustain their proliferative needs. Glutaminolysis is the reaction by which glutamine replenishes the tricarboxylic acid cycle and is used for the de novo synthesis of amino acids, nucleotides, fatty acids, and glutathione. Telaglenastat (CB-839) is a small-molecule glutaminase inhibitor (GLS1), currently being studied in several clinical trials for the treatment of various cancers.Epigenetic dysregulation is the alteration of gene expression without changes in the nucleotide sequence. DNA methylation consists of the addition of a methyl group to a cytosine ring, repressing gene transcription. Histone acetylation is the addition of an acetyl group to the histone tail, maintaining chromatin relaxation, allowing gene expression. Recent studies have pointed to a link between dysregulation of metabolism and epigenetics. With this in mind, the study of combined therapeutic approaches, namely, with hypomethylating agents [azacitidine (AZA) and decitabine (DAC)] and histone deacetylase inhibitors [vorinostat (SAHA) and panobinostat (PANO)], may improve the treatment of CLL.CLL cells may have a functional BCR receptor, which promotes tumor progression and growth through induced signaling pathways. Ibrutinib (IBRU) is a drug already approved for the treatment of CLL. It is a BTK inhibitor, thus resulting in repression of BCR activity.In this project, the CLL cell line, HG-3, was used and the effect of CB-839 monotherapy and in combination with 2.5μM AZA, 0.5μM DAC, 0.5μM SAHA, 5nM PANO or 0.25μM IBRU was evaluated. Metabolic activity was assessed by the resazurin assay. Death, cell cycle and mitochondrial membrane potential were studied by flow cytometry using annexin V /7-AAD, PI/RNAse and JC-1 labeling, respectively. Cell death was further analyzed by observing the morphological characteristics by light microscopy, after May-Grunwald Giemsa staining. The expression of genes related to glutaminolysis (GLS1, GLS2, GLUD1, GLUD2) was evaluated by qPCR. The results were statistically analyzed considering a significance level of 95% (p <0.05).CB-839 monotherapy induced a dose- and time-dependent inhibition of metabolic activity after the first 24 hours of incubation [IC50 (48h): 151.2nM, p<0.001]. Epigenetic modulators and IBRU in monotherapy were also effective in reducing cellular metabolic activity. Notably, the therapeutic combinations of CB-839 with the aforementioned drugs induced more pronounced inhibitory effects than either compound alone (5nM CB-839 + 2.5μM AZA: 1.4x; 5nM CB-839 + 0.5μM DAC: 1.3x; 5nM CB-839 + 0.5μM SAHA: 1.2x; 5nM CB-839 + 5nM CLOTH: 1.4x; 5nM CB-839 + 0.25μM IBRU: 1.1x; p<0.001).CB-839 simultaneously induced apoptosis and cell cycle blockage in the G0/G1 phase. The therapeutic combinations also induced apoptosis. The combinations with DAC, PANO and IBRU also induced cell cycle arrest in G0/G1, demonstrating that the mechanisms of action of these drugs may result from the interaction of different pathways. The morphological analysis of the cells treated with the therapeutic combinations showed an increase in the number of cells with characteristics of apoptosis and presence of vacuolization. This suggests that autophagy may be one of the mechanisms that mediate the therapeutic effects induced by CB-839.The results suggest that the drugs induced mitochondrial membrane depolarization (250nM CB-839: 0.19x; 5nM CB-839 + 2.5μM AZA: 0.21x; 5nM CB-839 + 0.5μM DAC: 0.13x; 5nM CB- 839 + 0.5μM SAHA: 0.21x, p<0.05; 5nM CB-839 + 5nM CLOTH: 0.22x, p<0.01; 5nM CB-839 + 0.25μM IBRU: 0.30x, p<0 .01). This demonstrates that glutaminolysis is a fundamental pathway in the homeostasis of this organelle.CB-839 induced noticeable changes in the gene expression of the GLS2 (2x, p<0.01) and GLUD2 (3x, p<0.05) genes. In contrast to the combination with DAC, which demonstrated a significant increase in the expression of GLS1 (2.25x, p<0.05), the remaining compounds did not induce significant changes in the genes studied.In summary, the results corroborate that CB-839 potentiated the therapeutic effect of epigenetic modulators, suggesting a complex relationship between metabolism and epigenetic alterations. Inhibition of BCR signaling and glutaminolysis has also demonstrated synergistic therapeutic effects in CLL. The results indicate the potential applicability of CB-839, both as monotherapy and in combination with epigenetic modulators, or IBRU, for the treatment of CLL.

A leucemia linfocítica crónica (LLC) é a leucemia mais comum em países ocidentais, caraterizada pela expansão clonal de linfócitos B. Existem ainda vários desafios na terapêutica da LLC, como os perfis de toxicidade em doentes idosos. A reprogramação metabólica consiste na adaptação do metabolismo das células tumorais de forma a sustentar as suas necessidades proliferativas. A glutaminólise é a reação através da qual a glutamina reabastece o ciclo dos ácidos tricarboxílicos e é utilizada para a síntese de novo de aminoácidos, nucleótidos, ácidos gordos e glutationa. O Telaglenastat (CB-839) é uma pequena molécula inibidora da glutaminase (GLS1), atualmente em estudo em vários ensaios clínicos para o tratamento de diversas neoplasias. A desregulação epigenética consiste na alteração da expressão génica sem modificações na sequência nucleotídica. A metilação do DNA consiste na adição de um grupo metilo a um anel de citosina, reprimindo a transcrição de genes. A acetilação das histonas é a reação de adição de um grupo acetilo à cauda das histonas, mantendo o relaxamento da cromatina, permitindo a expressão génica. Estudos recentes têm apontado para uma ligação entre a desregulação do metabolismo e a epigenética. Neste sentido, o estudo de abordagens terapêuticas combinadas, nomeadamente, com agentes hipometilantes azacitidina (AZA) e decitabina (DAC) e inibidores das deacetilases das histonas vorinostat (SAHA) e panobinostat (PANO), pode melhorar o tratamento da LLC.As células de LLC podem ter um recetor BCR funcional, que promove a progressão e o crescimento tumoral através das vias de sinalização induzidas. O ibrutinib (IBRU) é um fármaco já aprovado para o tratamento da LLC. Este é um inibidor de BTK, resultando assim na repressão da atividade do BCR. Neste projeto, utilizou-se a linha celular de LLC, HG-3, e avaliou-se o efeito do CB-839 em monoterapia e em combinação com 2,5μM AZA, 0,5μM DAC, 0,5μM SAHA, 5nM PANO ou 0,25μM IBRU. A atividade metabólica foi avaliada pelo ensaio da resazurina. A morte, o ciclo celular e o potencial da membrana mitocondrial foram estudados por citometria de fluxo, recorrendo à marcação com anexina V/7-AAD, PI/RNAse e JC-1, respetivamente. A morte celular foi ainda analisada através da observação das características morfológica por microscopia ótica, após coloração May-Grunwald Giemsa. A expressão de genes relacionados com a glutaminólise (GLS1, GLS2, GLUD1, GLUD2) foi avaliada por qPCR. Os resultados foram analisados estatisticamente considerando um nível de significância de 95% (p <0,05).O CB-839 em monoterapia induziu uma inibição da atividade metabólica dependente da dose e do tempo após as primeiras 24 horas de incubação [IC50 (48h): 151,2nM, p<0.001]. Os moduladores epigenéticos e o IBRU em monoterapia foram também eficazes na redução da atividade metabólica celular. Notavelmente, as associações terapêuticas do CB-839 com os fármacos citados anteriormente induziram efeitos inibitórios mais pronunciados que cada composto isolado (5nM CB-839 + 2.5μM AZA: 1,4x; 5nM CB-839 + 0.5μM DAC: 1,3x; 5nM CB-839 + 0.5μM SAHA: 1.2x; 5nM CB-839 + 5nM PANO: 1.4x; 5nM CB-839 + 0.25μM IBRU: 1.1x; p<0.001). O CB-839 induziu simultaneamente apoptose e bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. As combinações terapêuticas também induziram apoptose. As combinações com o DAC, PANO e IBRU induziram também bloqueio do ciclo celular em G0/G1, demonstrando que os mecanismos de ação destes fármacos poderão resultar da interação de diferentes vias. A análise morfológica das células tratadas com as combinações terapêuticas demonstrou um aumento do número de células com características de apoptose e presença de vacuolização. Isto sugere que a autofagia pode ser um dos mecanismos que medeia os efeitos terapêuticos induzidos pelo CB-839. Os resultados sugerem que os fármacos induziram a despolarização da membrana mitocondrial (250nM CB-839: 0.19x; 5nM CB-839 + 2.5μM AZA: 0,21x; 5nM CB-839 + 0.5μM DAC: 0,13x; 5nM CB-839 + 0.5μM SAHA: 0,21x, p<0,05; 5nM CB-839 + 5nM PANO: 0,22x, p<0,01; 5nM CB-839 + 0.25μM IBRU: 0,30x, p<0,01). Isto demonstra que a glutaminólise é uma via fundamental na homeostasia deste organelo.O CB-839 induziu alterações notórias na expressão génica dos genes GLS2 (2x, p<0.01) e GLUD2 (3x, p<0.05). Além da combinação com o DAC, que demonstrou um aumento significativo na expressão da GLS1 (2,25x, p<0.05), os restantes compostos não induziram alterações significativas nos genes estudados.Em suma, os resultados corroboram o CB-839 potenciou o efeito terapêutico dos moduladores epigenéticos, sugerindo uma relação complexa entre o metabolismo e as alterações epigenéticas. A inibição da sinalização do BCR e da glutaminólise também demonstrou efeitos terapêuticos sinérgicos na LLC. Os resultados indicam a potencial aplicabilidade do CB-839, tanto em monoterapia como em combinação com moduladores epigenéticos, ou IBRU, para o tratamento da LLC.