Determinação da Eficácia Biológica Relativa do Lutécio-177 em tumores com diferentes fenótipos

Abstract

Neuroendocrine tumours (NETs) are a relatively rare group of tumours, with a prevalence of about 2% within all malignant oncological pathologies. This tumour group, which develops from cells of the endocrine system, is quite heterogeneous. About 45% of patients who suffer from this pathology do not respond to conventional therapy, which can be explained by intratumoural heterogeneity. This type of tumour has an overexpression of type 2 somatostatin receptors (SSTR2). The somatostatin-receptor complex potentiates the internalization of the radiopharmaceutical and its therapeutic effect. Lutetium-177 is a radionuclide that emits β- particles, X-rays and γ-rays, Auger electrons (AE) and internal conversion electrons, with a physical half-life of 6.7 days. It forms a complex with DOTATATE, a peptide analogue of somatostatin that has high affinity for SSTR2. Lutetium-177 began to be an object of interest because it emits γ-rays with energies between 100 to 200 keV, an optimal range for imaging, and also emits β- radiation, which makes it suitable for therapy. The main goal of this project is to study the relative biological effectiveness (RBE) of 177Lu-DOTATATE for tumours of different phenotypes, in this case, pancreatic cancer and glioblastoma, in order to establish a relation between dose and biological effect. To that end, the cell lines under study were characterized, namely for their SSTR expression, the kinetics of radiotracers were studied and the survival of cells after irradiation with 177Lu-DOTATATE was evaluated.Therefore, cell lines representative of both pancreatic cancer (MIA PaCa-2) and glioblastoma (U-87MG, U-373MG, T98G) were used. For the evaluation of SSTR expression, the Western Blot technique was performed. For the uptake studies, two different experimental approaches were carried out. In the first one, cells were incubated with 177Lu-DOTATATE (25 µCi/mL), and samples were taken up from 5 to 180 min to calculate the percentage of uptake. In the second one, cells were incubated with 177Lu-DOTATATE (0.417 µCi/mL), and samples were taken up from 5 to 240 min to calculate the percentage of membrane adsorption and cell internalization, thus obtaining the percentage of total uptake. Clonogenic assays were performed after exposing cells to increasing initial activities of 177Lu-DOTATATE (0.1-2.5 MBq/mL) and increasing doses of 60Co (0,5-6 Gy, used as reference radiation). After 12 days, colonies were stained and survival factor (SF) was calculated. Two situations were considered for the irradiation time: 4 hours of irradiation and 12 days of irradiation. The MIRD method was used to calculate the absorbed doses by the cells through the values of the incorporated activity.SSTR expression was not detected in MIA PaCa-2 cells, while U-87 MG cells expressed SSTR1 and SSTR2a and U-373 MG cells expressed SSTR1, SSTR2a and SSTR5. For the first protocol used to evaluate the 177Lu-DOTATATE kinetics, the percentage of maximum total uptake for MIA PaCa-2, U-87 MG, U-373 MG and T98G cells was0.85%, 0.71%, 0.76% and 0.31%, respectively. For the second protocol performed to evaluate the 177Lu-DOTATATE kinetics, the percentage of maximum total uptake for MIA PaCa-2, U-87 MG and U-373 MG cells was 2.32%, 13.66% and 14.06%, respectively, being the membrane adsorption fraction always higher than the cellular internalization fraction. The survival of MIA PaCa-2 cells was around 70 to 75% for a dose of approximately 0.4 Gy (irradiation at 4 hours) and 0.8 Gy (irradiation at 12 days). For U-87 MG cells, the survival fraction (FS) was around 40% for a dose of 1 Gy (irradiation at 4 hours) and around 6 Gy (irradiation at 12 days). For U-373 MG cells, it was around 70 to 75% for a dose of approximately 0.4 Gy (irradiation at 4 hours) and about 3 Gy (irradiation at 12 days). In all cell lines, RBE showed higher values when an irradiation time of 4 hours was considered, compared to the values obtained when an irradiation of 12 days was considered.The results obtained point to an influence of SSTR expression in the uptake of 177Lu-DOTATATE. MIA PaCa-2 cells, for which SSTR were not detected, presented the lowest total uptake values, compared to U-87 MG and U-373 MG cells, which express SSTR. The fact that the membrane adsorption fraction was always higher than the cellular internalization fraction is in line with the mechanism of action of 177Lu-DOTATATE, which forms a complex with the SSTR. Generally, irradiation with low doses of 177Lu-DOTATATE was found to induce a decrease in cell survival in all cell lines. This response was dependent on the radiation dose and the cell line under study. U-87 MG cells showed a higher RBE value, which may indicate a radioresistance profile. It is noteworthy that cell survival and, consequently, the RBE value obtained for glioblastoma cell lines (U-87 MG and U-373 MG) was quite different, which indicates that ionizing radiation resulted in effects depending on the tumor phenotype.

Os tumores neuroendócrinos (NETs) consistem num grupo de tumores relativamente raros, com uma prevalência de cerca de 2% dentro de todas as patologias oncológicas malignas. Este grupo tumoral, que se desenvolve a partir de células do sistema endócrino é bastante heterogéneo, sendo que cerca de 45% dos doentes que sofrem desta patologia não respondem à terapia convencional, o que pode ser explicado pela heterogeneidade intratumoral. Este tipo de tumores apresenta uma sobre expressão de recetores de somatostatina tipo 2 (SSTR2). O complexo somatostatina-recetor potencia a internalização do radiofármaco e o efeito terapêutico do mesmo. O Lutécio-177 é um radionuclídeo emissor de partículas β-, raios X, raios γ, eletrões Auger (AE) e eletrões de conversão interna, com meia-vida física de 6,7 dias, e que forma um complexo com o DOTATATE, um péptido análogo de somatostatina que apresenta alta afinidade para o SSTR2. O principal objetivo deste projeto é estudar a eficiência biológica relativa (RBE) do 177Lu-DOTATATE em tumores de diferentes fenótipos, no caso, cancro do pâncreas e glioblastoma, a fim de estabelecer uma relação entre dose e efeito biológico. Com esse intuito, foram caracterizadas as linhas celulares em estudo, nomeadamente para a sua expressão de SSTR, foi estudada a cinética de radiotraçadores e foi avaliada a sobrevivência das células após irradiação com 177Lu-DOTATATE.Assim, foram utilizadas linhas celulares representativas de cancro do pâncreas (MIA PaCa-2) e de glioblastoma (U-87MG, U-373MG, T98G). Para a avaliação da expressão de SSTR foi realizada a técnica Western Blot. Para os estudos de captação foram realizadas duas abordagens experimentais diferentes. Na primeira, as células foram incubadas com 177Lu-DOTATATE (25 µCi/mL), tendo sido retiradas amostras dos 5 aos 180 min para o cálculo da percentagem de captação. Na segunda, as células foram incubadas com 177Lu-DOTATATE (0,417 µCi/mL), tendo sido retiradas amostras dos 5 aos 240 min para o cálculo da percentagem de adsorção à membrana e de internalização celular, e cuja soma corresponde à percentagem de captação total. Os ensaios clonogénicos foram realizados após a exposição das células a atividades iniciais crescentes de 177Lu-DOTATATE (0,1-2,5MBq/mL) e a doses crescentes de 60Co (0,5-6 Gy, utilizada como radiação de referência). Após 12 dias, as colónias foram coradas e o fator de sobrevivência (FS) foi calculado. Foram considerados duas situações para o tempo de irradiação: as 4 horas de irradiação e 12 dias de irradiação. O método MIRD foi utilizado para o cálculo das doses absorvidas pelas células através dos valores da atividade acumulada.Através do Western Blot, verificou-se que não foi detetada expressão dos SSTR em estudo nas células MIA PaCa-2, as células U-87MG apresentaram expressão de SSTR1 e SSTR2a e as células U-373 MG apresentaram expressão de SSTR1, SSTR2a e SSTR5. Com o primeiro protocolo de avaliação da cinética do 177Lu-DOTATATE, a percentagem de captação total máxima para as células MIA PaCa-2, U-87 MG, U-373 MG e T98G foi 0,85%, 0,71%, 0,76% e 0,31%, respetivamente. Com o segundo protocolo de avaliação da cinética do 177Lu-DOTATATE, a percentagem de captação total máxima para as células MIA PaCa-2, U-87 MG e U-373 MG foi 2,32%, 13,66% e 14,06%, respetivamente, sendo que a fração de adsorção à membrana foi sempre superior à fração de internalização celular. A sobrevivência das células MIA PaCa-2 foi 70 a 75% para uma dose de aproximadamente 0,4 Gy (irradiação a 4 horas) e de 0,8 Gy (irradiação a 12 dias). Para as células U-87 MG foi cerca de 40% para uma dose de 1 Gy (irradiação a 4 horas) e cerca de 6 Gy (irradiação a 12 dias). Para as células U-373 MG foi de 70 a 75% para uma dose de aproximadamente 0,4 Gy (irradiação a 4 horas) e de cerca de 3 Gy (irradiação a 12 dias). Em todas as linhas celulares, a RBE apresentou valores superiores quando se considerou um tempo de irradiação de 4 horas, em comparação com os valores obtidos quando se considerou uma irradiação de 12 dias.Os resultados obtidos apontam para a influência da expressão de SSTR na captação de 177Lu-DOTATATE. As células MIA PaCa-2, cuja expressão de SSTR não foi detetada, apresentaram os valores de captação total mais reduzidos, face às células U-87 MG e U-373 MG, que apresentaram expressão de SSTR. O facto de a fração de adsorção à membrana ter sido sempre superior à fração de internalização celular está alinhado com o mecanismo de ação do 177Lu-DOTATATE, o qual forma um complexo com o SSTR. As células U-87 MG foram as que apresentaram um valor de RBE mais elevado, o que poderá ser indicativo de um perfil de radioresistência nas mesmas. Realça-se o valor da RBE para as linhas celulares de glioblastoma (U-87 MG e U-373 MG) foi bastante distinto, o que indica que a radiação ionizante se traduziu em efeitos dependentes do fenótipo tumoral, comprovando que o mesmo tipo de tumor poderá ter respostas diferentes ao mesmo tipo de terapêutica.