Characterization Of The Genetic Profile Of Patients With Frontotemporal Lobar Degeneration And Establishment Of Their Fibroblast Cell Lines

Abstract

A degenerescência lobar frontotemporal (DLFT) é a segunda causa mais comum de demência em indivíduos com menos de 65 anos de idade. Caracteriza-se pela degeneração seletiva dos lobos frontais e temporais, originando diferentes fenótipos. Clinicamente, os pacientes podem desenvolver alterações do comportamento, da linguagem ou de ambos, em conformidade com dois subtipos clínicos: variante comportamental (bvFTD) ou afasia primária progressiva (APP). Este último subtipo pode ser dividido em duas categorias: afasia progressiva não fluente (nfv-APP), ou afasia progressiva fluente (sv-APP). Também podem sobrepor-se a outras doenças, tais como Doença do Neurónio Motor (DNM), Parkinsonismo (PD), entre outras.A DLFT é geralmente herdada segundo um padrão autossómico dominante. Em Portugal, cerca de 50% dos casos têm história familiar positiva com mutações em dois genes principais, granulin precursor (GRN) e open reading frame 72 of chromosome 9 (C9orf72).É importante referir que esta tese faz parte de um projeto de três anos, recentemente financiado, intitulado "Modelar a Demência Frontotemporal em organoides cerebrais humanos". Na verdade, constitui a primeira parte do referido projeto, cujo objetivo foi caracterizar o perfil genético dos pacientes com DLFT e estabelecer as respetivas linhas celulares de fibroblastos.Assim, neste estudo, caracterizámos o perfil genético de 11 doentes, clinicamente diagnosticados com DLFT, e estabelecemos as respetivas linhas celulares. Para tal, foram utilizadas várias técnicas de biologia molecular: quantificação de PGRN no soro, extração e quantificação de DNA, PCR's, sequenciação de Sanger, análise de fragmentos, análise de NGS, extração e quantificação de RNA, e cultura de fibroblastos humanos.Neste estudo, demonstrámos a importância de avaliar os níveis de PGRN no soro de doentes com DLFT como um método de rastreio para identificar indivíduos com mutações no gene GRN, uma vez que foram identificadas mutações patogénicas no gene GRN nos doentes que mostraram níveis diminuídos de PGRN no soro.Através da sequenciação de Sanger, foram identificadas 3 mutações heterozigóticas no gene GRN (p.W304Gfs*57, p.S301Cfs*61 e p.Q257Pfs*27). Através da análise de fragmentos, foram identificados 5 doentes heterozigóticos com um alelo expandido no gene C9orf72. Finalmente, através da análise de NGS, foram identificados 3 casos esporádicos.A quantidade de mRNA expressa nas linhas de fibroblastos, derivadas de cinco biópsias de pele de diferentes doentes, foi analisada por PCR em tempo real. Foi possível confirmar que os doentes heterozigóticos, com uma mutação no gene GRN, têm um valor PGRN inferior ao produzido por indivíduos sem mutação neste gene. No entanto, este mesmo grupo tem um nível mais elevado de PGRN do que os pacientes homozigóticos com mutação no gene GRN.Também foi possível ver que genes relacionados com a PGRN, tais como: PSAP, SORT1, TFEβ e ATP6v0 sofreram uma diminuição na sua expressão. Contudo, o único gene que mostrou uma alteração estatisticamente significativa foi o ATP6v0 (P < 0.01).Este trabalho continuará a ser desenvolvido no futuro com a análise genética de novos doentes recrutados, e com o estabelecimento das respetivas linhas celulares de fibroblastos que irão ser posteriormente reprogramadas em iPSCs. Além disso, avaliações de novos biomarcadores, particularmente capazes de medir os níveis de proteína de poly(GP) poderão ter lugar assim como uma análise genética mais alargada a outros genes relacionados com o PGRN, tais como o gene CTSD.

Frontotemporal lobar degeneration (FTLD) is the second most common cause of dementia in individuals under 65 years of age. It is characterized by selective degeneration in the frontal and temporal lobes, leading to different phenotypes. Clinically, patients may develop changes in behavior, language, or both, conforming to two clinical subtypes: a behavioral variant (bvFTD) or a primary progressive aphasia (PPA). The latter subtype can be divided into two categories: non-fluent progressive aphasia (nfv-PPA), or fluent progressive aphasia (sv-PPA). They can also overlap with other disorders, such as Motor Neuron Disease (MND), Parkinsonism (PD), and others.FTLD is usually inherited in an autosomal dominant pattern. In Portugal, about 50% of cases have a positive family history with mutations in two major genes, granulin precursor (GRN) and the open reading frame 72 of chromosome 9 (C9orf72).Noteworthy, this thesis is part of a newly funded 3-year project entitled "Modeling frontotemporal dementia diseases in human brain organoids". In fact, it constitutes the first part of the project, in which the goal was to characterize the genetic profile of FTLD patients and establish their respective fibroblast cell lines.Thus, in this study, we characterized the genetic profile of 11 patients, clinically diagnosed with FTLD, and established their respective cell lines. To this end, several molecular biology techniques were used: PGRN quantification in serum, DNA extraction and quantification, PCR's, Sanger sequencing, fragment analysis, NGS analysis, RNA extraction and quantification, and culture of human fibroblasts.We demonstrated the importance of assessing serum PGRN levels in FTLD patients as a screening tool for identifying individuals with mutations in the GRN gene since a pathogenic GRN mutation was identified in the patients who showed decreased levels of PGRN in serum.Through Sanger sequencing, 3 different heterozygous mutations in the GRN gene were identified (p.W304Gfs*57, p.S301Cfs*61 and p.Q257Pfs*27). By fragment analysis, 5 heterozygous patients with an expanded allele in the C9orf72 gene were identified. Finally, by NGS analysis, 3 sporadic cases were identified.The amount of mRNA expressed by fibroblast cell lines, derived from five skin biopsies from different patients, was analyzed by real-time PCR. It was possible to confirm that heterozygous patients with a mutation in GRN have a lower PGRN value than the one produced by individuals without a mutation in the gene. However, this same group has a higher level of PGRN than homozygous patients with a mutation in GRN.It was also possible to see that PGRN-related genes such as: PSAP, SORT1, TFEβ and ATP6v0 were decreased expressed. However, the only gene that showed a statistically significant change was ATP6v0 (P < 0.01).This work will be continued in the future with the expansion of the genetic analysis to new recruited patients, as well as the establishment of new fibroblast cell lines and subsequent reprogramming of these cells into iPSCs. In addition, new biomarkers assessment could also take place, particularly towards poly(GP) protein levels and the genetic analysis could be extended to other genes related to PGRN, such as the CTSD gene.