Evaluation Of Patients With Neurological Diseases Due To Nucleotide Repeat Expansions

Abstract

As doenças causadas por expansões são uma classe de doenças genéticas que resultam da expansão de repetições no DNA. Estas repetições têm vários tamanhos, desde nucleótidos simples, trinucleotideos, tetranucleotideos, hexanucleotideos ou mais longos. Os doentes têm fenótipos específicos e idades de início e estas doenças estão frequentemente associadas ao fenómeno da antecipação. Assim, os sinais e sintomas destas doenças genéticas, tendem a tornar-se mais graves e/ou a aparecer numa idade mais precoce à medida que a doença é transmitida de uma geração para a seguinte. Até ao momento, existem mais de 40 doenças distintas causadas por repetições de expansões na sequência de DNA. Neste trabalho, centrámos o nosso estudo na caracterização genética de doentes com doenças causadas por expansões de repetições, como por exemplo: Ataxia de Friedreich, Degenerescência Lobar Frontotemporal, Esclerose Lateral Amiotrófica, Doença de Huntington e Doença de Machado Joseph. O nosso objetivo foi estabelecer diferentes técnicas moleculares para detetar e quantificar o tamanho das expansões patogénicas nos doentes estudados. A Ataxia de Friedreich (OMIM # 229300) é uma ataxia espinocerebelar autossómica recessiva. Mais de 95% dos doentes têm a expansão da repetição trinucleotidica GAA no intrão 1 do gene FXN enquanto que os restantes 5 % têm uma mutação pontual neste gene. Neste sentido, a análise molecular no gene FXN foi otimizada, bem como a deteção das expansões de repetições GAA neste gene. Foram estudados dez doentes, seguidos no Serviço de Neurologia do CHUC. Em nenhum dos doentes foi identificada qualquer mutação pontual ou expansão de repetições patogénicas no gene FXN. Assim, não foi possível confirmar o diagnóstico de Ataxia de Friedreich nos doentes referenciados com suspeitas do diagnóstico clínico de Ataxia de Friedreich. A Degenerescência Lobar Frontotemporal (OMIM # 600274) e a Esclerose Lateral Amiotrófica (OMIM # 105550) são doenças neurodegenerativas autossómicas dominantes com uma idade de início habitualente inferior a 55 anos, nas quais uma expansão de repetição hexanucleotídica no gene C9orf72 é a causa genética mais comum. Assim, neste estudo, foi implementado um novo método para quantificar o tamanho do alelo expandido em cinquenta e seis doentes identificados como portadores da expansão patogénica G4C2. Assim, foram identificados 53 doentes com um alelo expandido (>145 repetições de G4C2), enquanto que em 3 doentes o alelo expandido identificado foi mais pequeno (variando entre 38-78 repetições de G4C2). A doença de Huntington (OMIM #143100) é uma doença neurodegenerativa progressiva autossómica dominante no cérebro, causada por uma expansão de repetição trinucleotidica de CAG no exão 1 do gene HTT. Assim, dez doentes foram avaliados por um novo método implementado no Laboratório de Neurogenética para detetar a presença de um alelo expandido no gene HTT, e em cinco doentes foi possível confirmar o diagnóstico clínico de Doença de Huntington.A doença de Machado Joseph (OMIM # 109150) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante de início tardio que envolve predominante os sistemas cerebelares, piramidal, extrapiramidal, neurónio motor, e oculomotor. A causa genética é uma mutação instável que envolve a expansão da repetição de CAG na região codificante do gene ATXN3.Assim, desenvolvemos um método in-house, envolvendo STR-PCR e RP-PCR, para detetar o número de expansões de repetições de CAG no gene ATXN3 em dezasseis doentes, dos quais quatro foram identificados como tendo um alelo expandido típico da doença de Machado Joseph. Assim, neste estudo tivemos oportunidade de implementar várias técnicas moleculares para detetar as expansões de repetições patogénicas em doentes com diferentes doenças neurológicas, tais como: Ataxia de Friedreich, Degenerescência Lobar Frontotemporal, Esclerose Lateral Amiotrófica, Doença de Huntington e Doença de Machado Joseph, utilizando kits comerciais e/ou métodos in-house. É importante referir que no futuro, estes métodos serão incluídos no Laboratório de Neurogenética para avaliar doentes com suspeitas clínicas de uma destas doenças. Nos doentes em que confirmámos a presença de uma expansão de repetições patogénicas, é particularmente importante a sua referência bem como a dos seus familiares para uma consulta de aconselhamento genético devido ao fenómeno de antecipação observado em algumas destas doenças. Finalmente, no futuro será importante aumentar o número de doentes estudados com cada umas destas patologias no sentido estabelecer correlações genótipo-fenótipo.

Repeat expansion disorders are a class of genetic diseases that are caused by expansions in DNA repeats. These repeats can be of various sizes such as: trinucleotide, tetranucleotide, hexanucleotide or longer. The affected patients have specific phenotypes and onset age and these diseases are often associated with the phenomenon of anticipation. Thus, the signs and symptoms tend to become more severe and/or appear at an earlier age as the disorder is passed from one generation to the next. At the moment, there are over 40 distinct diseases caused by DNA repeat expansions. In the present work, we focus our study on the genetic characterization of patients with repeat expansion disorders, such as: Friedreich's Ataxia, Frontotemporal Lobar Degeneration, Amyotrophic Lateral Sclerosis, Huntington's Disease and Machado Joseph Disease. We aimed to set up different molecular techniques to detect and quantify the size of the pathological expansions in these patients.The Friedreich's ataxia (OMIM # 229300) is an autosomal recessive spinocerebellar ataxia. More than 95% of patients have expanded GAA trinucleotide repeats in intron 1 of the FXN gene whereas the remaining 5% of the cases have point mutations in this gene. Therefore, the mutation analysis in the FXN gene was optimized as well as the analysis of the GAA repeat expansions in this gene and ten patients followed in the Neurology Department of CHUC have been studied. None of the patients harbor any point mutation or pathogenic repeat expansions in FXN gene. Thus, we could not confirm the Friedreich’s Ataxia diagnosis in any of the patients referred with the suspected clinical diagnosis of Friedreich Ataxia. The Frontotemporal Lobar Degeneration (OMIM # 600274) and the Amyotrophic Lateral Sclerosis (OMIM # 105550) are neurodegenerative disorders with an onset age typically lower than 55 years. They are autosomal dominant diseases in which an hexanucleotide repeat expansion in the C9orf72 gene is the most common genetic cause. Therefore, in the present study, a new method was set up to quantify the size of the expanded allele in fifty-six patients known as carriers of the pathogenic G4C2 expansion. Thus, 53 individuals were identified with one expanded allele (>145 G4C2 repeats), while 3 patients harbor a smaller expanded allele (ranging from 38-78 G4C2 repeats). The Huntington’s Disease (OMIM #143100) is a progressive brain autosomal dominant disease, caused by an expansion of a CAG trinucleotide repeat encoding in exon 1 of the HTT gene. Thus, ten patients were evaluated by a new method set up in the laboratory to detect the presence of an expanded allele in the HTT gene and in five patients it was possible to confirm the clinical diagnosis of Huntington’s Disease.The Machado Joseph Disease (OMIM # 109150) is an autosomal dominant neurodegenerative disease of late onset that predominantly involves the cerebellar, pyramidal, extrapyramidal, motor neuron, and oculomotor systems. The genetic cause is an unstable CAG repeat expansion mutation in the coding region of the ATXN3 gene. Thus, we developed an in-house method, involving STR-PCR and RP-PCR assays, to detect the number of CAG repeats expansions in the ATXN3 gene in sixteen patients. Of those, four were identified as having an expanded allele typical of Machado Joseph Disease. Therefore, in the present study we were able to set up several molecular approaches to detect the pathological expansions in patients with different Neurological diseases such as: Friedreich's Ataxia, Frontotemporal Lobar Degeneration, Amyotrophic Lateral Sclerosis, Huntington’s Disease and Machado Joseph Disease, using commercial kits and/or in-house methods. In the future these methods will be included in the Neurogenetic laboratory in a routine basis to evaluate patients with the suspected clinical diagnosis of one of these diseases. For those patients to whom we confirmed that they harbor a pathogenic expansion, it is particular important the genetic counselling consultation due to the anticipation phenomenon observed in some of these diseases. Finally, in the future it will be also important to increase the number of patients studied to establish genotype-phenotype correlations.