Radiolabelling of Small Extracellular Vesicles for diagnostics and therapeutic applications

Abstract

Small Extracellular Vesicles (SEVs) are cell-based vesicles with a diameter of 30-200 nm, containing a large variety of miRNAs, proteins, mRNAs, and other biomolecules, which play an important role in cell-to-cell communication and immune regulation.SEVs have been acquiring increasing interest for their use in diagnostics and therapeutics for diseases such as acute myocardial infarction, Ischemic stroke, and cancer. They present themselves as biomarkers for diagnostics and as drug delivery systems for therapeutics. For this, SEVs cargo can be used as possible biomarkers for diagnostics but also for therapeutics since they present the capability of causing a cellular response in the recipient cell, or exogenous drugs can be loaded onto the SEV. Furthermore, SEVs can be conjugated with imaging probes through various strategies, enabling their use for diagnostics purposes conjugated with imaging platforms.Positron emission tomography (PET) imaging platform is a nuclear imaging strategy, which means it requires the use of a radioisotope as an imaging probe for non-invasive in vivo tracking of these imaging probes. SEVs can be conjugated with the radioisotopes used in PET, enabling its use as a vehicle for these imaging probes. Therefore, the PET imaging platform offers the possibility of non-invasive in vivo tracking of SEVs.In this work, our aim was to label SEVs with a PET imaging agent for its use for diagnostics purposes. To fulfil our aim, we radiolabelled SEVs with 89Zirconium (89Zr), a positron-emittinggradioisotope with a half-life of 72h, which is adequate for in vivo long-term imaging using this imaging platform. The complexation of SEVs with 89Zr4+ was achieved by using a bifunctionalchelator, deferoxamine-maleimide (DFO), to consolidate the labelling of these two moieties, culminating in the formation of our complex, SEV-DFO-Zr. SEVs were isolated from three different sources (urine, mononuclear cells, and mesenchymal stem cells), and we characterized their size, isolation yield, purity, surface charge, morphology,and protein profiling, to assess their possible use in the conjugation with DFO-Zr and the functionality of the isolation protocols used. urine SEVs showed to be the purest and the ones with a higher isolation yield using our isolation protocol. The MNC SEVs presented a bigger mean size (160-190 nm). All three sources presented a morphology characteristic of SEVs and somewhat similar to one another. Also, all three sources showed to have a set of specific proteins that defined their protein profiling and seemed to express studied protein markers. Regarding the labelling, using our labelling strategy, Zr4+ complexed with DFO with 66% vicomplexation percentage, and SEV-DFO-Zr showed to be a stable complex, presenting 75% stability in plasma after 7 days of incubation, and with high purity (100%). We also showed that the labelling did not significantly affect the size, surface charge, and surface markers expression of native SEVs.We were also able to show that SEV-DFO-Zr presented good bioactivity and biocompatibility characteristics in vitro in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), having no cytotoxic effect, presenting a significant pro-survival effect, with a value of 123.4% of cell survival, and acquiring significantly higher cellular uptake than native SEVs (48.1% and 22.8%, respectively).Together, our results suggest that SEV-DFO-Zr shows great promise to be used in diagnostics conjugated with PET imaging platform.

Vesículas extracelulares pequenas (SEV) são vesículas provenientes de células com diâmetro de 30-200 nm, contendo uma grande variedade de miRNAs, proteínas, mRNAs e outras biomoléculas, que desempenham um papel importante na comunicação intercelular e na regulação imunológica. As SEVs têm vindo a ser alvo de cada vez mais interesse pelo seu uso em diagnóstico e terapêutica para doenças como enfarte agudo do miocárdio, enfarte isquémico e cancro. Estas podem ser biomarcadores para diagnóstico, bem como sistemas de entrega de fármacos para terapêutica. Para isso, o seu conteúdo molecular pode ser usado como biomarcador para diagnóstico, mas também para terapêutica, uma vez que apresenta a capacidade de desencadear uma resposta celular na célula recetora. Medicamentos exógenos também podem ser carregados nas SEVs, funcionalizando-as como sistemas de entrega de fármacos. Além disso, as SEVs podem ser conjugadas com sondas de imagiologia através de diversas estratégias, permitindo o seu uso para fins de diagnóstico, quando conjugados com diferentes técnicas de imagiologia.A tomografia de emissão com positrões (TEP) é uma técnica de diagnóstico de medicinanuclear, o que significa que requer o uso de um radioisótopo como uma sonda de imagiologiapara o rastreio in vivo não-invasivo desta sonda. As SEVs podem ser conjugadas com os radioisótopos usados em TEP, permitindo o seu uso como veículos para essas sondas de imagiologia. Dito isto, a plataforma de imagem TEP oferece a possibilidade de rastreio invasivo in vivo de SEVs.Neste trabalho, procurámos efetuar a radio marcação de SEVs com um agente de imagiologia de TEP para o uso em diagnóstico e terapêutica. Para isto, o nosso objetivo foi a radio marcação de SEVs com 89Zirconium (89Zr), um radioisótopo emissor de positrões com um tempo de meia-vida de 72h, que demonstra ser adequado para imagiologia a longo prazo in vivo fazendo uso desta plataforma de imagiologia. A complexação das SEVs com 89Zr4+ foi alcançada usando um ligando químico bifuncional, deferoxamina (DFO), para consolidar a ligação entre estas duas estruturas, resultando na formação do nosso complexo, SEV-DFO Zr. SEVs foram isoladas de três fontes diferentes (urina, células mononucleares e célulasestaminais mesenquimais), e procedemos à caracterização do tamanho, produtividade do isolamento, carga da superfície, morfologia e do seu perfil proteico, para avaliar o seu possível viiiuso na conjugação com DFO-Zr, bem como a funcionalidade dos protocolos de isolamento usados. SEVs de urina mostraram ser os mais puros e os que apresentaram uma maior produtividade por isolamento com o nosso protocolo de isolamento. As SEVs de células mononucleares apresentaram o maior tamanho médio (160-190 nm). Todas as fontes demonstraram ter uma morfologia característica de SEVs e aparentemente similar entre elas. Todas as três fontes também provaram ter um conjunto específico de proteínas que definem o seu perfil proteico e pareceram expressar os marcadores proteicos estudados. Passando para a marcação, usando a nossa estratégia de marcação, Zr4+ complexou com DFO com uma percentagem de complexação de 66%, e SEV-DFO-Zr mostrou ser um complexo estável, apresentando uma estabilidade de 75% em plasma após um período de incubação de 7 dias, e também mostrou alta pureza (100%). Também foi demonstrado que a marcação não afetou significativamente o tamanho, carga da superficie, e a expressão de marcadores de superfíciede SEVs nativas.Também conseguimos demonstrar que SEV-DFO-Zr apresentou características de bioatividade e biocompatibilidade adequadas, in vitro em células endoteliais da veia do cordão umbilical humano (HUVECs), não apresentando qualquer efeito citotóxico, com um efeito de pro-sobrevivência significativo, com um valor de 123,4% de sobrevivência celular, e conseguindo obter valores de internalização celular significativamente mais elevados do que SEVs nativas (48,1% e 22,8%, respetivamente).Em conjunto, os nossos resultados sugerem que o complexo SEV-DFO-Zr demonstra ser muito promissor para ser usado para diagnóstico conjugado com a técnica de imagiologia TEP.