Exploring the Missing Link Between Primary Cilia and Neurodevelopmental Disorders: The Case of a Novel MBD5 Variant in a Patient with Severe Epilepsy

Abstract

Nas sociedades modernas, as perturbações de neurodesenvolvimento (PNDs) têm-se tornado cada vez mais prevalentes. Embora as PNDs afetem milhões de indivíduos, a sua natureza complexa e heterogénea representa um grande desafio na descoberta dos mecanismos por detrás destas perturbações. Não obstante, cientistas têm sido capazes de associar centenas de genes e vias biológicas às PNDs, aproximando-nos de uma melhor compreensão destas condições. Sabe-se que uma abundância de genes, incluindo o gene methyl-CpG-binding domain 5 (MBD5), estão relacionados com as PNDs, mas o seu papel na patogénese de tais doenças permanece vastamente desconhecido. O gene MBD5 codifica a proteína MBD5, que se pensa regular a metilação do ADN no sistema nervoso central (SNC) e participar na reprogramação epigenética. As perturbações na expressão do MBD5 têm sido ligadas a um amplo espectro de características clínicas, sendo as mais comuns o atraso no desenvolvimento, incapacidade intelectual, comportamentos autistas, e convulsões. Atualmente, a terapia oferecida aos pacientes com PNDs associadas a MBD5 inclui medicação para convulsões, terapias da fala, comportamental, ocupacional e fisioterapia, bem como programas de educação especial. Coletivamente, as opções terapêuticas disponíveis não visam a condição em si, levando à necessidade de uma intervenção mais específica. Adicionalmente, pouco se sabe sobre os mecanismos e características fisiopatológicas específicas presentes em pacientes com variantes no MBD5. Estudos recentes sugerem que a haploinsuficiência de MBD5 pode levar à perturbação de um processo relacionado com os cílios primários no início do desenvolvimento cortical. Os cílios primários são organelos celulares em forma de antena, compostos por microtúbulos, e que atuam como pontos de controlo para a progressão do ciclo celular. Os cílios primários participam na deteção e transdução de sinais ambientais. Durante o neurodesenvolvimento, os cílios primários controlam o equilíbrio entre diferenciação e divisão das células progenitoras neurais (NPCs). Além disso, estes organelos são componentes vitais para a migração neuronal e para o estabelecimento de circuitos. Conhecendo as funções dos cílios primários ao longo do neurodesenvolvimento, não é de surpreender que a perturbação destes organelos esteja presente em muitas PNDs. Contudo, embora tenha sido estabelecida uma relação entre cílios primários e PNDs, os mecanismos moleculares patogénicos que os unem não foram ainda elucidados. Com o objetivo de explorar os papéis indefinidos do MBD5 e dos cílios primários nas PNDs, este projeto serviu-se de uma abordagem transversal: da clínica à bancada de laboratório. Primeiramente, reportámos o único caso conhecido em Portugal de uma variante de MBD5 numa criança do sexo feminino de 10 anos de idade. A paciente apresentava um fenótipo semelhante ao existente no Síndrome de Rett, com atraso de desenvolvimento e convulsões resistentes a medicação. A partir das células estaminais de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) provenientes da paciente, gerámos e caracterizámos uma nova linha de células estaminais pluripotentes induzidas (células iPS), permitindo o desenvolvimento de modelos celulares in vitro de haploinsuficiência de MBD5. Seguidamente, utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9, corrigimos a variante MBD5 presente nas células iPS derivadas da paciente, criando outra linha de iPS: um controlo isogénico, que mantém o background genético da paciente. A partir das células iPS derivadas da paciente e das células iPS editadas com CRISPR-Cas9, foram criadas células progenitoras neurais (NPCs), permitindo investigar o gene MBD5, bem como os cílios primários em células de origem neural. Finalmente, ao utilizar organóides cerebrais 3D saudáveis de origem humana, foi possível observar a presença de cílios primários num modelo altamente complexo do cérebro em desenvolvimento. Os nossos resultados indicam que as NPCs derivadas da paciente apresentam diferenças na expressão de MBD5 e RAI1, um gene relacionado com autismo, ao comparar com os NPCs editadas com CRISPR-Cas9. Estes dados apoiam a hipótese de que as PNDs podem ter alterações moleculares e celulares em comum. Adicionalmente, descobrimos que os cílios primários marcados com AC3 nas NPCs derivadas da paciente são mais longos do que os presentes nas NPCs editadas com CRISPR-Cas9. Relativamente aos organóides cerebrais 3D de origem humana, as nossas descobertas demonstram que os cílios primários estão presentes e bem orientados na zona ventricular, altamente proliferativa, bem como em neurónios desenvolvidos. Dados estes resultados, é possível concluir que as NPCs 2D e os organóides cerebrais 3D de origem humana são modelos fiáveis para o estudo dos cílios primários no neurodesenvolvimento. Com este projeto, foi possível trazer algum conhecimento sobre as contribuições do gene MBD5 e dos cílios primários para as PNDs.

In modern societies, neurodevelopmental disorders (NDDs) have become increasingly prevalent. Though NDDs affect millions of individuals, their complex and heterogenous nature presents as a major challenge when trying to uncover the mechanisms behind these disorders. Even so, scientists have been able to associate hundreds of genes and biological pathways to NDDs, bringing us closer to a better understanding of these conditions. A plethora of genes, including the methyl-CpG-binding domain 5 gene (MBD5), are known to be related to NDDs, but their role in the pathogenesis of such disorders remains widely unknown. The MBD5 gene encodes the MBD5 protein, which is thought to regulate DNA methylation in the central nervous system and take part in epigenetic reprogramming. Disruptions in the expression of MBD5 have been linked with a broad spectrum of clinical features, the most common being developmental delay, intellectual disability, autistic-like behaviors, and seizures. Currently, the therapy offered to patients with NDDs associated with MBD5 includes seizure medication, speech therapy, behavior therapy, physical and occupational therapy, as well as special education programs. Collectively, the therapeutic options available are not targeting the condition itself, raising the need for a more specific intervention. Furthermore, little is known regarding the specific pathophysiological mechanisms and features present in patients with MBD5 variants. Recent studies suggest that MBD5 haploinsufficiency can lead to the disruption of a primary cilium-related process early in cortical development. Primary cilia are microtubule-based antenna-like cellular organelles that act as checkpoints for cell cycle progression and aid in sensing and transducing environmental signals. During neurodevelopment, the primary cilia control the equilibrium of differentiation and division of neural progenitor cells (NPCs). Moreover, these organelles are vital components for neuronal migration and circuitry establishment. Knowing the functions of primary cilia throughout neurodevelopment, it comes as no surprise that the disruption of these organelles is present in many NDDs. However, though a relation has been established between primary cilia and NDDs, the pathogenic molecular mechanisms bringing them together are yet to be elucidated. With the goal of exploring the undefined roles of MBD5 and primary cilia in NDDs, this project took advantage of a transversal approach: from the clinic to the lab bench. Firstly, we reported the only known case in Portugal of a MBD5 variant in a 10-year-old female presenting with a Rett Syndrome-like phenotype, with developmental delay and drug-resistant seizures. From the patient’s stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHEDs), we generated and characterized a novel induced pluripotent stem cell (iPS cell) line, enabling the development of in vitro cellular models of MBD5 haploinsufficiency. Furthermore, using CRISPR-Cas9 technology, we corrected the MBD5 variant present in the patient-derived iPS cells, creating another iPS line: an isogenic control, which maintains the patient’s genetic background. From the patient-derived and the CRISPR-Cas9-edited iPS cell lines, neural progenitor cells (NPCs) were created, allowing to investigate the MBD5 gene, as well as primary cilia in cells of neural origin. Finally, by using healthy 3D human-derived cerebral organoids, it was possible to observe the presence of primary cilia in a highly complex model of the developing human brain.Our results indicate that the patient-derived NPCs present differences in the expression of MBD5 and RAI1, an autism-related gene, when compared to CRISPR-Cas9-edited NPCs. This data supports the hypothesis that NDDs may have common molecular and cellular alterations. Furthermore, we discovered that the AC3-stained primary cilia of the patient-derived NPCs are longer than the ones present in CRISPR-Cas9-edited NPCs. Regarding the 3D human-derived cerebral organoids, our findings show that primary cilia are present and well-oriented in the highly proliferative ventricular zone, as well as in developed neurons. Given these results, it is possible to conclude that the 2D NPCs and the 3D human-derived cerebral organoids are reliable models for the study of primary cilia in neurodevelopment.With this project, it was possible to shed some light on the contributions of MBD5 and primary cilia to NDDs. Though our understanding of neurodevelopment and NDDs is still limited, new knowledge regarding this subject may bring us closer to obtaining more effective and specific therapeutic targets for these conditions.