Preclinical evaluation of the therapeutic potential of sitagliptin in an animal model of multiple sclerosis

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a central nervous system autoimmune inflammatory disease and one of the most frequent and disabling neurological disease, especially in young adults aged between 20 and 40 years, being more frequent in women. According to several studies, it is estimated that more than 2 million people worldwide are affected by this disease and the exact etiology remains unknown. However, several risk factors have been attributed for development of this disorder, such as sunlight exposure, virus infection, smoking, microbiome alterations, genetic factors, among others. MS is characterized by a chronic inflammatory state promoted by the exacerbation of some immune cells, leading to myelin sheath degradation (demyelination) and neuroaxonal degeneration. Even though spontaneous remyelination can occur, it often fails and leave axons demyelinated. This process is mediated by oligodendrocyte progenitor cells (OPC´s) that respond to demyelination by activation, proliferation, migration to the injured site and differentiation into remyelinating oligodendrocytes. Because remyelination is associated with a lower disability, several therapeutic strategies have been adopted to enhance endogenous remyelination.DPP-IV inhibitors have been used to improve glucose metabolism in diabetic patients. Notably, aforesaid oral hypoglycemic drugs have been also suggested to directly or indirectly improve some demyelinating diseases. DPP-IV is ubiquitously expressed in several types of tissues, where it plays several roles, namely enzymatic. Several substrates of DPP-IV enzymatic activity have been described, such as GLP-1 and NPY, which hold the potential to exert neuroprotective and neurotrophic properties. More recently, it was demonstrated in vivo the potential remyelination effect of liraglutide, a GLP-1R agonist. Thus, the modulation of DPP-IV/GLP-1/NPY pathway may be an attractive approach for demyelinating conditions, including MS. Hence, the purpose of this work was to evaluate whether sitagliptin – a DPP-IV inhibitor – could enhance GLP-1 and NPY availability and, consequently, to alleviate demyelination and/or foster remyelination using the cuprizone-induced mouse model of MS. Six groups of 8-week-old C57BL/6J mice (n=10 each) were tested: Two groups under vehicle treatment during 5 and 7 weeks (CTRL W5 and CTRL W7) to serve as Controls for the demyelination (W5) and remyelination (W7) phases. Two other groups under cuprizone (CPZ) administration for 5 weeks (CPZ W5), one of them followed by suspension of cuprizone for further two weeks (CPZ W7) to analyze remyelination. The last two groups were subjected to the same CPZ protocols accompanied by Sitagliptin treatment between week 2.5 and the end of studies (CPZ W5+SITA and CPZ W7+SITA). Body weight and glycemia were monitored throughout the protocol. The cerebellum (CB) and the right hemisphere (RH) were used to evaluate markers of myelination (PLP and MBP), keyplayers of the DPP-IV pathway (DPP-IV, NPY, NPY-1R and GLP-1R), as well as parameters of inflammatory and redox status profiles (TNF-α, IL-1ß, Sod-1, Sod-2, NRF2, and iNOS) by using distinct methodologies, including mRNA expression by RT-PCR, protein density by immunostaining, as well as assays of enzymatic activity.The validation of the CPZ model of demyelination and remyelination was confirmed by the downregulation of the gene expression MBP and PLP in the CB and RH at week 5 and by the recovering of both markers at week 7. In the demyelination phase of the disease (W5), sitagliptin was able to significantly reduce mRNA expression of DPP-IV and GLP-1R in the CB and RH regions of the brain, as well as to reduce mRNA expression of NPY-1R in the RH. In addition, sitagliptin may have decreased neuroinflammation and oxidative stress, as viewed by the significantly reduced mRNA expression of IL-1ß and Sod-1 in the CB and RH, among other similar modifications. However, sitagliptin was unable to prevent demyelination given the incapacity to prevent the CPZ-evoked downregulation of mRNA expression of PLP and MBP in the CB and RH, as well as the reduction of kluver-barrera staining, observed in the CPZ W5 group. In the remyelination phase (W7), sitagliptin also reduced the mRNA expression in the CB and RH of markers of the DPP-IV pathway and of inflammation and oxidative stress, such as IL-1ß, Sod-1, Sod-2 and NRF2. However, sitagliptin not only was unable to accelerate remyelination and even caused its inhibition when compared with the CPZ W7 group that present recovered PLP and MBP gene expression levels. In conclusion, sitagliptin failed to prove efficacy as a therapeutic strategy to prevent demyelination and/or promote remyelination in the CPZ-intoxication mice model of MS, which might be due to the expressive anti-inflammatory effect demonstrated in both phases of the disease that may play a chief role in central regenerative processes. Further studies should be done to clarify this hypothesis.

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune que afeta o sistema nervoso central e é uma das doenças neurológicas mais frequentes e incapacitantes, afetando principalmente jovens adultos. É estimado que mais de 2 milhões de pessoas em todo o mundo sejam afetadas por esta doença e a sua exata etiologia permanece desconhecida. Vários fatores de risco têm sido atribuídos para o seu desenvolvimento: exposição solar desadequada, infeção viral, tabagismo, alterações no microbioma, fatores genéticos, entre outros. A EM é caracterizada por um estado inflamatório crónico promovido pela exacerbação de algumas células imunes, levando à degradação da bainha de mielina (desmielinização) e degeneração neuroaxonal. No entanto, a remielinização espontânea pode ocorrer, porém falha frequentemente, deixando os axónios desmielinizados. Este processo é mediado por células progenitoras de oligodendrócitos (OPC´s) que respondem à desmielinização por ativação, proliferação, migração para o local lesado e diferenciação em oligodendrócitos remielinizantes. Como a remielinização está associada a uma menor incapacidade, várias estratégias terapêuticas têm sido estudadas para potenciar a remielinização endógena. Os inibidores de DPP-IV têm sido usados para melhorar o metabolismo da glicose em pacientes diabéticos. Notavelmente, esses inibidores têm sido também sugeridos como tendo potencial para melhorar direta ou indiretamente algumas doenças desmielinizantes. A DPP-IV é expressa de forma ubíqua em vários tipos de tecidos, onde desempenha várias funções, nomeadamente enzimática. Vários substratos para a atividade enzimática da DPP-IV têm sido descritos, como GLP-1 e NPY, com o potencial de exercer propriedades neuroprotetoras e neurotróficas. Mais recentemente, foi demonstrado in vivo o potencial efeito de remielinização da liraglutide, um agonista do GLP-1R. Assim, a modulação da via DPP-IV/GLP-1/NPY pode ser uma abordagem atraente para condições desmielinizantes, incluindo a EM. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a sitagliptina – um inibidor de DPP-IV – poderia aumentar a disponibilidade de GLP-1 e NPY e, consequentemente, aliviar a desmielinização e/ou promover a remielinização usando o modelo de EM induzido por cuprizona. Seis grupos de ratos C57BL/6J de 8 semanas de idade (n=10 cada) foram testados: Dois grupos sob tratamento com veículo durante 5 e 7 semanas (CTRL W5 e CTRL W7) para servir como Controlo para as fases de desmielinização (W5) e remielinização (W7). Dois outros grupos foram sujeitos à administração de cuprizona (CPZ) por 5 semanas (CPZ W5), sendo que em um dos grupos houve suspensão de cuprizona por mais duas semanas (CPZ W7) para análise da fase de remielinização. Os dois últimos grupos foram submetidos aos mesmos protocolos mas adicionalmente foram tratados com sitagliptina entre a semana 2,5 e o final dos estudos (CPZ W5+SITA e CPZ W7+SITA).O peso corporal e a glicemia foram monitorizados durante todo o protocolo. O hemisfério direito (RH) após excisão do cerebelo (CB) foram as regiões escolhidas para avaliar marcadores de mielinização (PLP e MBP), moléculas relacionadas com a via da DPP-IV (DPP-IV, NPY, NPY-1R e GLP-1R), bem como parâmetros do perfil inflamatório e redox (TNF-α, IL-1ß, Sod-1, Sod-2, NRF2 e iNOS) usando metodologias distintas, incluindo expressão de mRNA por RT-PCR, densidade de proteínas por imunocoloração e ensaios de determinação da atividade enzimática. A validação do modelo CPZ nas fases de desmielinização e remielinização foi confirmada pela repressão da expressão génica de MBP e PLP no CB e RH na semana 5 e pela recuperação de ambos os marcadores na semana 7. Na fase de desmielinização da doença (W5), a sitagliptina foi capaz de reduzir significativamente a expressão de mRNA de DPP-IV e GLP-1R nas regiões CB e RH do cérebro, bem como reduzir a expressão de mRNA de NPY-1R no RH. Além disso, a sitagliptina pode ter diminuído a neuroinflamação e o stress oxidativo, tendo em conta a redução dos níveis de expressão génica de IL-1ß e Sod-1 no CB e RH,entre outras modificações semelhantes.No entanto, a sitagliptina foi incapaz de prevenir a desmielinização, dado que se verificou uma incapacidade de prevenir a regulação negativa da expressão de mRNA de PLP e MBP no CB e RH, bem como a redução da coloração de kluver-barrera, observada no grupo CPZ W5. Na fase de remielinização (W7), a sitagliptina também reduziu a expressão de mRNA no CB e RH dos marcadores da via DPP-IV e da inflamação e stress oxidativo, como por exemplo IL-1ß, Sod-1, Sod-2 e NRF2. No entanto, a sitagliptina não só não foi capaz de acelerar a remielinização, como também a inibiu quando comparada com o grupo CPZ W7 sem tratamento com sitagliptina, que recuperam os níveis de expressão génica de PLP e MBP para valores semelhantes ao grupo controlo. Em conclusão, a sitagliptina não provou ser uma estratégia terapêutica eficaz para prevenir a desmielinização e/ou promover a remielinização no modelo de EM em ratos.