Bioactive nanovesicles from umbilical cord blood to treat diabetic chronic wounds

Abstract

Worldwide, there are 382 million patients with diabetes and is estimated that this number will rise up to 592 million by 2035. Approximately 15% of these individuals have or will develop diabetic foot ulcer. The increase in the incidence and prevalence of chronic wounds demands the development of more efficient therapies. Advanced therapies including growth factor and cell based therapies have been tested with limited success. Recently, small extracellular vesicles (SEVs), also known as exosomes, carrying functional proteins and RNA have been evaluated as a potential therapeutic platform for chronic wounds. However, some issues need to be addressed before any clinical translation including (i) the selection of an ideal source of extracellular vesicles for chronic wounds and (ii) the development of deliver systems for the efficient release of SEVs. In the present work, we have evaluated the skin healing potential of SEVs isolated from umbilical cord blood mononuclear cells (hUCBMNCs) and we have further developed an advanced delivery system to enhance SEV therapeutic effect. Our results show that diabetic chronic wounds treated with the advanced delivery system containing SEVs healed faster, presenting, at day 10, a reduction of wound size to approximately 10% versus the reduction to approximately 40% observed for non-treated wounds. SEVs were collected from the conditioned media hUCBMNCs and isolated by sequential ultra-centrifugation and characterized for their morphology, surface marker expression, miRNA composition (by RNA deep sequencing and miRNAs validated by qRT-PCR) and in vitro and in vivo bioactivity tests. The SEVs presented a round morphology, size of 100-130 nm and zeta potential of -30mV. They show the presence of the following proteins at the surface CD9, CD81, CD63, TSG101 and CD45. SEVs were internalized by skin cells, keratinocytes, fibroblasts and endothelial cells in a concentration and time dependent manner, reaching a plateau between 16h to 24h. At 4h, approximately 50% of keratinocytes and fibroblasts and 20% of endothelial cells presented detectable levels of internalized SEVs (3 μg/mL). Our in vitro results demonstrated that SEVs increased cell proliferation (up to 50% in all three types of skin cells), enhanced cell survival under ischemic conditions (up to 50% in endothelial cells and 15% in fibroblasts and keratinocytes), promoted cell migration in a wound healing assay (up to 20% more in scratches inflicted in keratinocytes and fibroblasts monolayers) and induced endothelial cells to form tubes and a more complex network (from 20% to 30%). Our in vivo results show that SEVs are very effective in the treatment of diabetic and non-diabetic wounds. The bi-daily administration of low amounts of SEVs (0.02 μg) in wounds of diabetic mice lead to enhanced wound healing kinetics of approximately 20%, at day 10, as compared to the control group. Additionally, the healing was significantly enhanced by this treatment versus an advanced therapy approved by FDA and EMA (PDGFBB). In a subsequent stage of the work, we have developed an advanced drug delivery system for SEVs based on a light-triggerable hyaluronic acid hydrogel. The motivation here was to allow the remote delivery of SEVs according to specific needs. In this case, we have chemically immobilized SEVs to hyaluronic acid polymer chains by a photo-cleavable linker (PCL). This PCL was cleaved after exposure to UV/blue light releasing the SEVs. Our results show that the controlled release of SEVs into the wound site enhanced the wound healing kinetics, as evaluated by wound size measurements, histological and gene analyses. Our results further identified a very complex miRNA composition and miR-150-5p as the most prevalent in hUCBMNCs-SEVs and as partially responsible of the bioactivity of these exosomes by targeting iii the transcription factor c-Myb. Additionally, the system developed to control and sustain the delivery of SEVs to the wound is able to modulate the expression of miRNAs in the skin surrounding the wound, normalizing some miRNA levels, e.g. miR-150-5p, which can be responsible for better wound resolution. In summary, a new platform to delivery therapeutic SEVs was successfully developed and represents a promising tool for the treatment of chronic wounds.

No mundo existem cerca de 382 milhões de doentes diabéticos (2013), um número que se estima que chegue aos 592 milhões em 2035. Aproximadamente 15% destes doentes desenvolverão ulceras diabéticas, mais conhecidas como pé diabético. O desenvolvimento de terapias mais eficientes é necessário para fazer face ao contíno aumento da incidência e prevalência de feridas crónicas. Terapias baseadas em fatores de crescimento e cdllulares têm vindo a ser desenvolvidas e testadas, embora com sucesso limitado. Recentemente, o potencial terapeutico de pequenas vesiculas extracellulares (em inglês: Small Extracellular Vesicles – SEVs), comummente conhecidas como exosomas, que transportam biomoleculas funcionais (proteinas e RNAs), têm vindo a ser estudado pela comunidade cientifica como uma nova plataforma terapêutica para feridas crónicas. Contudo, alguns pontos relevantes têm ainda de ser avaliados da translação para o contexto clínico, incluindo (i) a selecção da fonte de células ideal para obtenção de vesiculas extracellulares para tratamento destas feridas e (ii) o desenvolvimento de um sistema que permita uma entrega eficiente destas vesiculas extracellulares na ferida. No presente trabalho, avaliamos o potencial regenerativo de SEVs secretadas por células mononucleares do sangue do cordão umbilical (em inglês: human Umbilical Cord Blood MonoNuclear Cells – hUCBMNCs) e desenvolvemos um sistema avançado para a entrega eficiente destas vesiculas na ferida, aumentando o seu potencial terapêutico. Os nossos resultados demontraram que feridas crónicas diabeticas tratadas com este sistema avançado contendo SEVs cicatrizam mais rapidamente, apresentando, 10 dias após o tratamento, uma redução significativa do tamanho da ferida para aproximadamente 10% da área da ferida original, versus uma redução até aproximadamente 40% nas feridas não tratadas. As SEVs foram obtidas do meio condicionado de hUCBMNCs por ultra-centrifugação sequencial e caracterizadas quanto à sua morfologia, expressão de marcadores membranares, composição de microRNAs (por RNA deep sequencing seguido de validação por RT-PCR) e bioactividade in vitro e in vivo. Estas SEVs apresentam uma morfologia esférica com cerca de 100-130 nm de diametro e possuem um potencial zeta que ronda os -30mV. Na sua superfície membranar possuem os marcadores proteicos típicos de exosomas, CD9, CD81, CD63 e TSG1101 e o marcador típico das células secretoras, o CD45. Estas SEVs foram internalizadas por diferentes tipos de células da pela, queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais, apresentado uma internalização dependente da sua concentração e do tempo de incubação, atingindo um plateau entre as 16h e 24h. Após 4h de incubação, aproximadamente 50% dos queratinócitos e fibroblastos e 20% deas células endoteliais apresentavam valores detectáveis de SEVs (3μg/mL) internalizados. Os nossos resultados in vitro demontraram que estas SEVs potenciavam a proliferação celular (com aumento de até 50% nos três tipos celulares estudados), aumentavam a sobrevivência das células a condições isquémicas (até 15% para queratinócitos e fibroblastos e até 50% para as células endoteliais), promoviam migração celular (até cerca de 20% mais, em rasgos (scratches) inflingidos numa monocamada de queratinócitos e fibroblastos em cultura) e induziam a formação de tubos nas células endoteliais, que apresentavam uma rede mais complexa (entre 20% a 30%). Os nossos resultados in vivo demonstraram, por sua vez, que estas SEVs são muito eficientes no tratamento de feridas diabéticas e não-diabéticas. A Administração bi-diária de baixas quantidades de SEVs (0.02 μg) em feridas infligidas a ratinhos diabéticos traduziu-se num aumento da cinética de cicatrização da ferida de aproximadamente 20% mais, quando comparado com o grupo controlo, ao dia 10 após início de tratamento. Adicionalmente, esta estratégia de tratamento mostrou cicatrização significativamente melhor do que a terapia avançada actualmente aprovada pela FDA e EMA (PDGFBB). Numa fase subsequente do trabalho, nós desenvolvemos um sistema avançado, que consistia num hidrogel de ácido hialurónico para administração de SEVs por acção da luz. O objectivo, era desenvolver um Sistema que permitisse controlar a libertação de SEVs de acordo com as necessidades específicas da sua aplicação. Neste caso, nós immobilizamos quimicamente as SEVs a candeias poliméricas de ácido hialurónico através moléculas fotossensíveis (em inglês: photo-cleavable linker - PCL). Este PCL era clivado por exposição à luz UV/azul libertando assim as SEVs. Os nossos resultados demontraram que a libertação controlada de SEVs na ferida melhorava ainda mais a cinética de cicatrização da mesma, de acordo com analyses de medida de área da ferida e análises histológicas e genéticas. Adicionalmente, analisámos a composição em microRNAs (miRs) dos exosomal, que se revelou bastante complexa e rica em diferentes miRs, e indentificámos o miR-150-5p como o mais prevalente nas SEVs de hUCBMNCs e como parcialmente responsável pela bioactividade destas vesiculas, através da modulação da expressão do factor de transcrição c-Myb. Adicionalmente, verificámos que o sistema desenvolvido para controlar e manter de forma sustentada a administração de SEVs na ferida tinha a capacidade de modular a expressão de miRs na pele circundante à ferida, levando à normalização dos níveis de alguns miRs, nomeadamente, o miR-150-5p, reforçando a sus importância para uma melhor resolução das feridas. Resumindo, uma nova plataforma de administração de SEVs foi desenvolvida com sucesso, apresentando-se como uma ferramenta de elevado potencial para o tratamento de feridas crónicas.