Sensitivity and resistance in chronic myeloid leukaemia to tyrosine kinase inhibitors: insights into molecular mechanisms

Abstract

Chronic myeloid leukaemia (CML) is a clonal disorder of haematopoietic stem cell characterised by BCR-ABL1 fusion gene. This gene codifies BCR-ABL oncoprotein that activates several downstream signalling pathways, essential in tumour cells growth and survival. Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) counteract the function of BCR-ABL oncoprotein, improving substantially the survival of CML patients. Despite the good results with TKI treatment, resistance to therapy become a significant challenge in this disease. The molecular mechanisms behind TKI resistance are multiple, including changes in BCR-ABL1, mechanisms that alter drug concentration or modify leukemic cells signalling network. The present study aimed to investigate the molecular mechanisms involved in sensitivity and resistance to TKIs in CML and the genetic variants related to these mechanisms. These goals will allow the identification of risk factors for disease development and new response and prognostic biomarkers, as well as explore new therapeutic approaches. First, we assessed the association of genetic variants of genes involved in TKI transport with susceptibility and prognosis of CML. For that, 10 SNVs on efflux (ABCB1 and ABCG2) and influx (SLC22A1 and SLC22A5) pumps genes were genotyped. The results showed three genetic variants associated with risk of CML development (two in ABCB1 and one in SLC22A5), two correlated with CML prognosis in SLC22A1 gene, and two of them correlated with CML predisposition and prognosis (each one in ABCG2 and SLC22A5). Furthermore, we found one variant of ABCG2 associated with drug response and risk of TKI resistance. Furthermore, as microRNAs (miRs) dysregulation have emerged as a crucial player in treatment response, we correlate the expression levels of miR-21, miR-26b and miR-451, with TKI response in CML patients. We found that patients without optimal response had highest levels of miR-21 and lower of miR-451. Using the combined profile of both miRs, we create a predictive model of optimal response after one year of treatment. This study highlights the role of miR-21 and miR-451 expression levels, at diagnosis, in predicting which patients will achieve the optimal response. Immunological status of patients influences drug response but can be changed by treatment. We characterised the immune system populations in 33 CML patients treated with TKIs, 8 CML patients treated with TKI plus interferon and 20 healthy controls. Patients receiving combination therapy had lower numbers of lymphocytes, but higher percentage of Treg, CD4+/PD-1+ and GR-MSDC cells compared to controls. Patients treated with TKIs differed from controls in Mo-MDSC cells levels. Inside of this group, we observed that patients treated with 2nd generation TKIs had lower percentages of CD4+ Treg and Gr-MDSC compared to patients under imatinib treatment, but higher levels of PD-1-co-expressing CD4+ cells. The results suggest that TKIs in combination with IFN-α may promote immunosuppression. Next, we created two in vitro imatinib-resistant models, where one mimics the poor adherence to treatment. These cells presented different degrees of resistance, being higher in the interruption model. We observed in both models alterations on influx and efflux transporters expression levels. Using a P-gP inhibitor (reversin 205) we reversed imatinib resistance, showing the relevance of efflux transporter to resistant phenotype and as therapeutic tool. These imatinib-resistant in vitro models allowed the study of new therapeutic approaches to circumvent TKI resistance. Given the role of drug transporters into TKI concentration, we explored the therapeutic potential of elacridar, a dual inhibitor of P-gP and BCRP, in sensitive and imatinib-resistant CML cell lines. Elacridar in monotherapy was not enough to achieve IC50 in any model but in combination with imatinib overcame resistance. This drug combination induced apoptosis, reduced cell proliferation rate and arrested CML cells in S phase. These data suggest that elacridar in combination with imatinib might represent a new therapeutic option to overcome TKI resistance. Knowing the activation of alternative signalling pathways in TKI resistance, we assess the therapeutic potential of everolimus, an mTOR inhibitor, on in vitro and ex-vivo CML models. Everolimus reduced the viability of sensitive and resistant cell lines, with activation of apoptosis and induction of cell cycle arrest. In ex-vivo studies, everolimus also reduced cell viability by increasing apoptosis of hematopoietic stem cells with low cytotoxicity to lymphocytes. The results suggest that everolimus could be an alternative therapeutic approach in CML, even in cases of imatinib resistance. Overall, the present study reflects the complexity of CML molecular mechanisms and their correlation with TKI response and resistance. These mechanisms could constitute new diagnostic and prognostic biomarkers, and new therapeutic targets.

A leucemia mieloide crónica (LMC) é uma doença clonal da célula estaminal hematopoiética caracterizada pela presença do gene fusão BCR-ABL1. Este gene codifica uma oncoproteína, que ativa vias de sinalização cruciais na proliferação e sobrevivência celulares. Os inibidores tirosina cinase (TKIs) bloqueiam a BCR-ABL, melhorando a sobrevivência dos doentes com LMC. Apesar dos bons resultados, a resistência aos TKIs tornou-se um desafio na abordagem da doença. A resistência aos TKIs é multifatorial e complexa, incluindo alterações no BCR-ABL1, modificações nos mecanismos que regulam a concentração de fármaco e ainda desregulação das vias de sinalização nas células leucémicas. O presente estudo teve como objetivo analisar os mecanismos moleculares envolvidos na sensibilidade e resistência aos TKIs na LMC e as variantes genéticas relacionadas com estes mecanismos. Esta análise pretendeu identificar novos fatores de risco para o desenvolvimento da doença e biomarcadores de resposta e prognóstico, bem como explorar novas opções terapêuticas. Inicialmente, analisamos a associação das variantes genéticas em genes envolvidos no transporte dos TKIs com a suscetibilidade e prognóstico na LMC. Assim, genotiparam-se 10 SNVs em genes de efluxo (ABCB1 e ABCG2) e influxo (SLC22A1 e SLC22A5). Identificaram-se três variantes genéticas associadas ao risco de desenvolvimento de LMC (duas no ABCB1 e uma no SLC22A5), duas variantes correlacionadas com o prognóstico da doença no SLC22A1, e duas variantes correlacionadas com a suscetibilidade e o prognóstico (uma no ABCG2 e outra no SLC22A5). Adicionalmente, uma variante do ABCG2 foi associada à resposta aos TKIs e ao risco de desenvolver resistência. A desregulação dos microRNAs (miRs) tem emergido como um importante fator na resposta à terapêutica. Assim, correlacionamos os níveis de expressão do miR-21, miR-451 e miR-26b com a resposta aos TKIs em doentes com LMC. Doentes que não atingem resposta ótima ao tratamento apresentaram níveis mais elevados de miR-21 e inferiores de miR-451. Com base no perfil destes miRs, criamos um modelo preditivo de resposta ótima ao final de um ano sob TKIs. Este estudo salienta o papel do mir-21 e miR-451 ao diagnóstico como fatores preditivos de resposta aos TKIs em doentes com LMC. O perfil imunológico dos doentes influencia e é influenciado pelo tratamento. Neste sentido, caracterizamos as populações do sistema imune em 41 doentes com LMC (33 tratados com TKIs e 8 sob tratamento combinado TKI com interferon-α) e em 20 controlos. Os doentes sob tratamento combinado apresentaram diminuição de linfócitos e aumento das células Treg, CD4+/PD-1+ e Gr-MDSC relativamente aos controlos. Nos doentes tratados com TKIs observaram-se diferenças nas Mo-MDSC face aos controlos. Dentro deste grupo, verificamos que doentes sob TKIs de 2ª geração apresentaram menos células CD4+ Treg e Gr-MDSC em relação aos doentes sob imatinib (IMA). No entanto, os primeiros apresentaram aumento de células CD4+/PD-1+. Os resultados sugerem que o tratamento combinado poderá induzir imunossupressão. Seguidamente, criamos dois modelos in vitro de LMC resistentes ao IMA, sendo que um deles mimetiza a fraca adesão ao TKI. Estes apresentaram diferentes graus de resistência, sendo esta superior no modelo de interrupção da terapêutica. Os modelos resistentes apresentaram alterações nos níveis de expressão dos transportadores de influxo e efluxo. Com um inibidor da P-gP (reversin 205) foi possível reverter a resistência, revelando importância dos transportadores de efluxo na aquisição de resistência e como alvos terapêuticos. Os modelos resistentes ao IMA permitem o estudo de abordagens terapêuticas para ultrapassar a resistência. Assim, exploramos o potencial terapêutico do elacridar (inibidor da P-gP e da BCRP) em linhas celulares sensíveis e resistentes ao IMA. Apesar do elacridar em monoterapia não ter atingido o IC50, a sua combinação com IMA induziu apoptose, reduziu a proliferação celular e bloqueou o ciclo celular. Os resultados demonstram que o elacridar em combinação com o IMA poderá representar uma nova opção terapêutica para superar a resistência aos TKIs. A ativação de vias de sinalização alternativas é um conhecido mecanismo de resistência à terapêutica. Assim, avaliamos o potencial terapêutico do everolimus (EVE; inibidor do mTOR) em modelos in vitro e ex-vivo de LMC. O EVE reduziu a viabilidade celular em modelos sensíveis e resistentes, com indução de apoptose e bloqueio do ciclo celular. Os estudos ex-vivo demonstraram que o EVE induz apoptose nas células CD34+ com baixa toxicidade nos linfócitos. Os resultados sugerem que o EVE poderá ser uma alternativa terapêutica em LMC, mesmo em casos de resistência ao IMA. Em conclusão, o presente estudo reflete a complexidade dos mecanismos moleculares envolvidos na LMC e correlaciona-os com a resposta e resistência aos TKIs. Estes mecanismos poderão constituir novos biomarcadores de diagnóstico, prognóstico, e novos alvos terapêuticos.