Microbial diversity and anaerobic metabolisms in the subsurface of the Iberian Pyritic Belt

Abstract

Río Tinto is an acidic river that originates at Peña de Hierro (Spain) and is characterized by its low pH values, high concentration of ferric iron, sulfate and heavy metals. Peña de Hierro, is localized in the Iberian Pyritic Belt (IPB), a geological formation that hosts one of the largest massive sulfide ore deposits known. Previous studies on the geomicrobiology of the deep subsurface of Río Tinto aquifer at Peña de Hierro have indicated the occurrence of microorganisms inhabiting rocks in the deep subsurface. Recent drilling studies, reaching deeper into the subsurface of the IPB, produced two boreholes. Gases such as hydrogen, carbon dioxide and methane as well as anions such as the nitrate, nitrite, acetate, formate, propionate were detected within both boreholes. This study focused as a starting point on culture-dependent methods to investigate the metabolic capacity of microbial populations inhabiting rock cores retrieved from several depths along both boreholes. The establishment of enrichment cultures designed to promote methanogenic and nitrate reducing activities resulted in methane production activity and nitrate reduction activity, respectively, from diverse rock samples of both boreholes. Positive enrichment of microorganisms with either metabolic capacity suggested that these pathways may potentially play a role in supporting microbial populations within the subsurface. Culture-dependent techniques were also applied to isolate and identify the culturable microbial diversity enriched from selected cultures with methane production or nitrate reducing activity. These studies resulted in the isolation of several members of the domain Bacteria, belonging to the phyla Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes. Facultative anaerobic and strict anaerobic strains were identified as affiliated with bacterial strains known for their metabolic capacity for fermentative metabolism, nitrate reduction, sulfate reduction, iron reduction and acetogenesis. Additionally, an isolation assay with selected methane-producing enrichment cultures, was also performed with focus on the isolation of methanogenic archaea. So far, this study has resulted in the co-culture of an archaeal strain affiliated with the genus Methanosarcina in culture with a bacterial strain. Three enrichment cultures with active methane production were selected to further study the diversity of microbial populations enriched under methanogenic conditions by 16S rRNA gene pyrosequencing. Data retrieved indicated the enrichment of additional bacterial populations not identified by culture-dependent assays. Bacteria affiliated with known sulfate reducing, fermentative, nitrate reducing and acetogenic bacteria were identified. This study identified the enrichment from rock cores of archaeal populations affiliated with members of the orders Methanosarcinales and Methanocellales. So far, this is the first report of the presence of members of Methanocellales from a deep terrestrial subsurface environment. Both culture-dependent studies and culture-independent applied methods revealed the occurrence of diverse subsurface rock dwelling microbial populations which may potentially play an important role in the cycling of carbon, nitrogen, sulfur and iron elements through the subsurface ecosystem. Integrative analysis of data within the IPB drilling project indicated that members of the genus Tessaracoccus are widely distributed in the subsurface. To further access metabolic potential of members of this genus isolated from the deep subsurface, Tessaracoccus sp. strain T2.5-30, isolated in this study from BH10 at 138.5 meters below surface, was selected for whole genome sequencing. Analysis of the annotated genome suggested potential for heterotrophic growth. A tentative complete pathway for fixation of inorganic carbon, as well as the capacity for nitrate reduction with ammonia formation and fermentative pathways, were found encoded in the genome. Further studies with enrichment cultures established under methanogenic conditions resulted in the establishment of three subcultures. Preliminary studies based on in situ hybridization, electron microscopy and cloning indicated the co-enrichment in bacterial and archaeal populations. Identification of microbial diversity by 16S rRNA gene cloning for each culture identified so far the presence of bacteria affiliated with either the genus Paenibacillus, Sphingomonas, Rhodoplanes and an archaeon affiliated with the genus Methanobacterium.

O Río Tinto tem origem na Peña de Hierro (Espanha), sendo caracterizado pelo seu pH acídico, elevadas concentrações de ferro férrico, sulfato e metais pesados. A área da Peña de Hierro está localizada na Faixa Piritosa Ibérica (FPI) que consiste numa formação geológica que inclui um dos maiores sulfuretos maciços conhecidos. Estudos geomicrobiológicos prévios do subsolo profundo, no aquífero do Río Tinto na Peña de Hierro, indicam colonização microbiana de rochas. A perfuração recente de dois furos resultou no alcançe de uma maior profundidade no subsolo da FPI. Gases como hidrogénio, dióxido de carbono e metano, bem como aniões nitrato, nitrito, acetato, formato e propionato foram detectados em ambos os furos. O nosso estudo recorreu como ponto de partida à aplicação de métodos dependentes de cultura, para investigar a capacidade metabólica de populações microbianas, que habitam a zona central de rochas de diferentes profundidades em ambos os furos. O estabelecimento de culturas de enriquecimento desenhadas para promover atividades metanogénicas ou de redução de nitrato, resultou na produção de metano ou redução de nitrato, respetivamente, em diversas rochas de ambos os furos. O enriquecimento de microrganismos com a respectiva capacidade metabólica investigada, sugere que essas vias metabólicas podem potencialmente desempenhar um papel no suporte de populações microbianas no subsolo. Técnicas dependentes de cultura foram também aplicadas para isolar e identificar a diversidade microbiana cultivável, enriquecida a partir de culturas selecionadas com produção de metano ou redução de nitrato. Estes estudos resultaram no isolamento de vários membros do domínio Bacteria pertencentes aos filos Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes. Foram identificadas estirpes anaeróbias facultativas e anaeróbias estritas que apresentam maior similaridade com estirpes bacterianas com capacidade metabólica descrita para fermentação, redução de nitrato, de sulfato, de ferro férrico ou acetogénese. Adicionalmente foi realizado um ensaio focado no isolamento de arqueas metanogénicas a partir de culturas de enriquecimento com produçao de metano ativa. Até ao momento, este estudo resultou na co-cultura de uma arquea associada filogeneticamente ao género Methanosarcina em cultura com uma estirpe bacteriana. Foram selecionadas três culturas de enriquecimento com produção ativa de metano para uma caracterização adicional da diversidade microbiana enriquecida em condições metanogénicas, recorrendo à pirosequenciação do gene 16S rRNA. Os dados indicam o enriquecimento adicional de populações bacterianas não identificadas por ensaios dependentes de cultura. Foram identificados organismos relacionados com bactérias descritas como redutoras de sulfato, fermentativas, redutoras de nitrato ou acetogénicas. Este estudo resultou ainda na identificação de arqueas filogeneticamente relacionadas com membros das ordens Methanosarcinales e Methanocellales. Até ao momento, este é a primeira descrição da presença de membros da ordem Methanocellales num ambiente subterrâneo profundo. Ambos os estudos dependentes e independentes de cultura revelaram a ocorrência de diversas populações microbianas subterrâneas que podem potencialmente desempenhar um papel importante no ciclo do carbono, nitrogénio, enxofre e ferro através do ecossistema subterrâneo. A análise integrativa de dados no projeto de perfuração da FPI indicou que membros do género Tessaracoccus estão amplamente distribuídos no subsolo. Para investigar o potencial metabólico de membros deste género, isolados a partir do subsolo profundo, a estirpe Tessaracoccus sp. T2.5-30, isolada a partir do furo BH10 a 138,5 metros abaixo da superfície, foi selecionada para sequenciação integral do genoma. A análise e anotação do genoma sugere um potencial para crescimento heterotrófico. Uma possível via para a fixação de carbono inorgânico, assim como a capacidade de redução de nitrato com formação de amónia e vias fermentativas, foram encontradas codificadas no genoma. Estudos adicionais com culturas de enriquecimento estabelecidas em condições metanogénicas resultaram em três subculturas. Resultados preliminares baseados em hibridação in situ, microscopia eletrónica e clonagem indicam o co-enriquecimento de populações bacterianas com arqueas. A identificação da diversidade microbiana através da clonagem do gene 16S rRNA para cada cultura, identificou a presença de bactérias afiliadas com os géneros Paenibacillus, Sphingomonas, Rhodoplanes e uma arquea relacionada filogeneticamente com o género Methanobacterium.