Investigating transcriptional modifications of the autophagy pathway in Machado-Joseph Disease

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD) or spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is a late onset neurodegenerative disorder, being the most common autosomal dominantly inherited ataxia worldwide. This disorder is caused by an expansion of a CAG trinucleotide repeat in the ATXN3 gene that is translated into an expanded polyglutamine (polyQ) in the corresponding ataxin-3 (ATXN3) protein. The abnormally expanded protein acquires toxic properties and is prone to misfolding and aggregation, accumulating as neuronal inclusions particularly in the nucleus of neurons, and inducing toxicity and degeneration of different brain regions. The aggregation of the protein is being related with the pathogenesis of the disease by leading to the disfunction of cell quality control systems, as is the case of the autophagy pathway. In fact, previous observations of our group and others have implicated autophagy defects in the accumulation of mutant ATXN3 (mutATXN3) aggregates and neurodegeneration in different models of MJD and human brain tissue. Moreover, although ATXN3 physiological functions are still not fully understood, it has been shown to be involved in transcription regulation and consequently, the alteration of function in pathological conditions. How dysregulation of the autophagy pathway occurs in Machado Joseph disease, particularly at the transcriptional level, has not yet been investigated. Therefore, the main goal of this project was to investigate transcriptional modifications of the autophagy pathway in models of MJD and to manipulate the levels of affected transcripts aiming at reestablishment of efficient autophagic clearance of misfolded and aggregated ATXN3. In the first part of the project, described in chapter 2, we thoroughly characterized the autophagy-related transcriptional dysregulation in several models of the disease, providing evidence of different pathways wherein autophagy is impaired in MJD. We observed a general transcriptional dysfunction, both in early and late steps of autophagy, that may be explained by the observed dysregulation of transcription factors (TFs) known to mediate transcriptional regulation of autophagy pathway. Interestingly, we detected a robust decrease of Unc-51-like kinase (ULK) 1 and ULK2 expression and found evidence of close association of ULK1 deficiency with the disease progression in a transgenic mouse model of MJD. The importance of this protein in autophagy was further evaluated, in Chapter 3, in an in vitro model of the disease, in which its knockout (KO) led to impairment of the autophagy pathway and a consequent accumulation of mutATXN3. Conversely, the re-establishment of ULK1 levels resulted in the clearance of mutATXN3, which suggests that ULK1 may be a potential therapeutic target. Moreover, we identified a single nucleotide polymorphism (SNP) in ULK1 gene pointing it out as a possible modifier of age at onset (AO) in MJD patients. Given these evidence, we next evaluated ULK1 and ULK2 as a potential therapeutic target. In vitro, upon ULK1 and both transcripts overexpression, we observed a decrease in soluble and aggregated mutATXN3 protein levels. The same beneficial effect on the clearance of ATXN3 toxic species was observed in vivo after transduction of the striatum of mice with viral vectors encoding ULK1/2. Furthermore, in a transgenic mouse model, we found that the reestablishment of ULK1/2 levels led to the amelioration of motor behaviour performance and disease-associated neuropathology, suggesting that ULK1/2 plays an important role in the correct function of the autophagic pathway. In the last part of this project, described in Chapter 5, we tested a pharmacological approach to promote activation of autophagy in MJD context. We demonstrate that Carbamazepine (CBZ) is able to a) activate autophagy, b) reduce soluble and aggregated mutATXN3 levels in in vitro and in vivo models of disease and c) reduce neuropathological and motor deficits upon post-symptomatic treatment of a transgenic mouse model of MJD. Moreover, we showed that CBZ treatment for four weeks induced a partial recovery from transcription alterations in autophagy machinery, which can contribute for the observed beneficial effects in the different models of disease. In summary, in this project, we elucidated impairments within autophagy pathway in MJD and identified new targets for stimulation of this misfolded proteins clearance mechanism. Furthermore, we developed two promising gene and pharmacological- based therapeutic approaches, opening new directions towards the development of an effective therapy for MJD.

A doença de Machado-Joseph (DMJ) ou ataxia espinocerebelosa tipo 3, é uma doença neurodegenerativa de início tardio, sendo a forma de ataxia hereditária dominante mais comum a nível mundial. Esta doença é causada por uma excessiva repetição trinucleótido CAG no gene ATXN3 que é traduzida numa cadeia poliglutamínica expandida na proteína ataxina-3 (ATXN3). Esta proteína anormalmente expandida adquire propensão para perda da sua conformação normal, aquisição de toxicidade e para agregação e acumulação, sobretudo no núcleo dos neurónios, o que leva à degenerescência de diferentes regiões do cérebro. A presença de inclusões neuronais tem sido relacionada com a patogénese da doença por levar à disfunção dos sistemas de controlo de qualidade das células, como é o caso da via da autofagia. De facto, observações anteriores do nosso grupo e de outros têm implicado defeitos da via autofágica na acumulação de agregados de ataxina-3 mutante (ATXN3mut) e neurodegenerescência em diferentes modelos da DMJ. Além disso, embora a função fisiológica da ATXN3 não esteja ainda completamente esclarecida, tem sido descrito o seu envolvimento na regulação da transcrição e consequentemente, uma alteração da sua função em condições patológicas. Como ocorre a desregulação da via da autofagia, em particular ao nível da transcrição, não foi ainda investigado. Assim, o principal objetivo deste projeto foi investigar as modificações transcricionais em modelos da DMJ e interferir com os níveis dos transcritos afetados visando o restabelecimento de uma eficiente eliminação das espécies tóxicas da ATNX3mut através da autofagia. Na primeira parte do projeto, descrita no Capítulo 2, caracterizámos detalhadamente a desregulação transcricional em diversos modelos da doença, fornecendo evidências sobre as diferentes vias em que a autofagia está alterada na DMJ. Observámos uma disfunção transcricional generalizada, quer em passos iniciais quer tardios da autofagia, sendo possivelmente explicado pela desregulação observada em fatores de transcrição conhecidos por mediar a regulação transcricional da via da autofagia. Neste trabalho detetámos ainda uma robusta diminuição da expressão das proteínas ULK1 e ULK2, sendo que a expressão da ULK1 parece estar intimamente relacionada com a progressão da doença num modelo transgénico de murganho da doença. A importância desta proteína na autofagia foi seguidamente avaliada no Capítulo 3, num modelo in vitro da doença, em que o seu knockout (KO) levou ao comprometimento da via da autofagia e a consequente acumulação da ATXN3mut. Por outro lado, o restabelecimento dos níveis de ULK1 levaram à eliminação da ATXN3mut, o que sugere que o ULK1 pode ser um potencial alvo terapêutico. Para além disso, identificámos um polimorfismo de nucleótido simples (SNP) no gene do ULK1, apontando-o como um possível modificador do início da doença em humanos. Dadas estas evidências, de seguida avaliámos o ULK1 e ULK2 como potenciais alvos terapêuticos. In vitro, após a sobre-expressão do ULK1 e dos dois transcritos em simultâneo, observámos uma diminuição nos níveis de ATXN3 solúvel e agregada. O mesmo efeito benéfico foi observado in vivo após transdução do estriado de murganhos com vectores virais que codificavam para as ULK1/2. Num modelo transgénico da doença, mostrámos que o restabelecimento dos níveis de ULK1/2 levou à melhoria da performance motora e neuropatologia associada à doença, sugerindo que as ULK1/2 desempenham um importante papel na correta função da via da autofagia. Na última parte do projeto, descrita no Capítulo 5, testámos uma abordagem farmacológica para ativação da autofagia no contexto da DMJ. Demonstrámos que a carbamazepina (CBZ) a) ativa a autofagia, b) reduz os níveis de ATXN3mut solúvel e agregada em modelos in vitro e in vivo da doença e c) reduz os défices neuropatológicos e motores num modelo transgénico pós-sintomático da DMJ. Além disso, mostrámos que o tratamento com CBZ durante quatro semanas é capaz de reverter algumas das alterações transcricionais induzidas pela DMJ na maquinaria da autofagia, o que pode contribuir para os efeitos benéficos observados nos diferentes modelos de doença. Em resumo, neste projeto, evidenciámos os defeitos na maquinaria da autofagia na DMJ e identificámos novos alvos para estimulação da eliminação de espécies tóxicas da proteína. Além disso, desenvolvemos duas promissoras abordagens terapêuticas, genética e farmacológica, abrindo assim novas direções para o desenvolvimento de uma terapia eficaz para a DMJ.