Analysis of CREB-regulated genes in cellular models of Alzheimer's Disease - Role of HDAC inhibitor (s)

Abstract

A doença de Alzheimer (AD, do inglês “Alzheimer’s disease) é a doença neurodegenerativa mais comum associada à idade, que afeta predominantemente o hipocampo e o córtex cerebral. A AD é caracterizada por marcadores neuropatológicos, nomeadamente os depósitos extracelulares de péptido beta-amilóide (Aβ) e as tranças neurofibrilares formadas por Tau hiperfosforilada. A localização seletiva dos recetores NMDA (do inglês “N-methyl-D-aspartate”) (NMDAR) parece influenciar o seu papel na função neuronal. Em particular, a ativação sináptica dos NMDARs desencadeia uma cascata de eventos que contribuem para a neuroprotecção através da regulação da expressão de um conjunto de genes pró-sobrevivência dependentes da ativação do CREB (do inglês “cAMP-response element binding protein”) e da supressão transcricional de genes pró-morte. Em contraste, a ativação de NMDAR extrassinápticos tem sido associada à inativação das vias reguladas por CREB e ativação de processos conducentes à morte celular.Assim, no presente trabalho, pretendemos analisar a influencia da ativação sináptica versus extrasináptica dos recetores do glutamato (e.g. os NMDAR) na ativação do CREB, associada à alteração dos níveis de Ca2+ intracelular, retenção de Ca2+ mitocondrial e do potencial mitocondrial transmembranar, e a sua correlação com os níveis de mRNA de dois genes regulados pelo o CREB, BDNF e GADD45γ, em neurónios corticais da DA derivados de ratinhos transgénicos APP/PS1 (produz Aβ intracelular) e em neurónios corticais de rato Wistar expostos a oligómeros de Aβ1-42 (AβO). Para além disso, pretendemos analisar a influência dos inibidores de deacetilases de histonas (HDACis, do inglês “histone deacetylase inhibitor”’), tacedinalina e butirato de sódio, nestas condições experimentais. Em neurónios controlo observámos um aumento na ativação/fosforilação do CREB no resíduo Ser133 (pCREB) após a ativação sináptica e extrasináptica dos NMDARs. Em neurónios expostos a AβO observámos uma diminuição no pCREB após a ativação sináptica e extrasináptica dos NMDARs. Associado às alterações dos níveis de p(Ser133)CREB, observámos também uma diminuição nos níveis de mRNA do BDNF, nomeadamente, após a ativação sináptica dos NMDARs, em neurónios APP/PS1 e neurónios tratados com AβO. Encontrámos também uma diminuição dos níveis de mRNA do GADD45γ em condições basais e após a ativação global e extrasináptica dos NMDARs em neurónios APP/PS1, e uma diminuição em condições basais e após a ativação sináptica dos NMDARs em neurónios incubados com AβO. Estes resultados sugerem que a exposição de 24 h aos AβO promove a internalização dos NMDARs, diminuindo os níveis de Ca2+ intracelular e de pCREB após a ativação sináptica e extrasináptica dos NMDARs. De salientar que, os HDACis aparentemente demonstraram um efeito neuroprotetor em neurónios corticais de rato Wistar, uma vez que: i) aumentaram a acumulação de Ca2+ mitocondrial e ΔΨm após a estimulação com glutamato; ii) preveniram a diminuição do influxo de Ca2+ e aumentaram o ΔΨm após a estimulação sináptica/estimulação dos recetores do glutamato em neurónios pré-expostos a AβO; e iii) preveniram a diminuição do influxo de Ca2+ e melhoraram o potencial mitocondrial após a ativação seletiva dos NMDARs extrassinápticos em neurónios tratados com AβO. Para além disso, os HDACis melhoraram o influxo de Ca2+ através da ativação sináptica e extrasináptica dos NMDARs e regularam a retenção de Ca2+ mitocondrial e a hiperpolarização mitocondrial, independentemente de Aβ.Em suma, a atividade dos NMDARs e a sinalização regulada pelo o CREB encontram-se afetados em neurónios corticais da DA, o que parece ser melhorado na presença dos HDACi.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common age-related neurodegenerative disease that largely affects the hippocampus and the cerebral cortex. AD is characterized by neuropathological hallmarks, namely extracellular deposits of beta-amyloid peptide (Aβ) and neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated Tau. Selective location of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) appears to influence their role in neuronal function. In particular, activation of synaptic (Syn) NMDARs triggers a cascade of events that contribute to neuroprotection by regulating the expression of a set of pro-survival genes regulated by cAMP-response element binding protein (CREB) and transcriptional suppression of pro-death genes. In contrast, activation of extrasynaptic (ESyn) NMDARs has been associated with inactivation of CREB-regulated pathways and activation of cell death processes.Thus, in the present work we aimed to analyse the influence of Syn versus ESyn activation of glutamate receptors (e.g. NMDAR) on CREB activation associated with changes in intracellular Ca2+ levels, mitochondrial Ca2+ retention and mitochondrial transmembrane potential, and their correlation with mRNA levels of two CREB-regulated genes, BDNF and GADD45γ, in AD primary cortical neurons derived from APP/PS1 transgenic mice (producing intracellular Aβ) or Wistar rat cortical neurons exposed to Aβ1-42 (AβO) oligomers. Furthermore, we aimed to analysed the influence of histone deacetylase inhibitors (HDACis), tacedinaline and sodium butyrate, under these experimental conditions. In control/non-exposed neurons we observed an increase in CREB activation/phosphorylation at Ser133 (pCREB) following activation of both Syn and ESyn NMDARs. In contrast, a decrease in pCREB was detected after activation of both Syn and ESyn NMDARs in neurons exposed to AβO. Correlated with changes in p(Ser133)CREB levels, we further observed a decrease in BDNF mRNA levels after Syn activation of NMDARs in both APP/PS1 and AβO-treated neurons. We also found a decrease in GADD45γ mRNA levels under basal conditions and after global and ESyn activation of NMDARs in APP/PS1 neurons, and a decrease at basal conditions and after Syn NMDARs activation in neurons exposed to AβO. Data suggest that 24 h exposure to AβO promotes NMDAR internalization, decreasing intracellular Ca2+ and pCREB after Syn and ESyn NMDAR activation. Of relevance, HDACis apparently showed a protective effect in AD rodent cortical neurons, since they: i) increased mitochondrial Ca2+ accumulation and ΔΨm after stimulation with glutamate; ii), prevented the decrease in Ca2+ influx and increased ΔΨm after Syn NMDARs/glutamate receptors stimulation in cortical neurons pre-exposed to Aβ; and iii) prevented the decrease in Ca 2+ influx and improved mitochondrial potential following selective activation of ESyn NMDARs in AβO-treated neurons. Thus, HDACis improve Ca2+ influx through Syn and ESyn NMDARs activation and regulate both mitochondrial Ca2+ retention and mitochondrial hyperpolarization independently of Aβ.In conclusion, NMDARs activity and CREB regulated signalling are affected in AD cortical neurons, which appear to be ameliorated in the presence of HDACi.