TRAP1-P66sHC Interplay in the Modulation of Oxidative Stress in Lung Cancer

Abstract

As células cancerígenas remodelam o seu metabolismo e mecanismos de produção de energia para garantir a sua sobrevivência e a sua rápida proliferação, especialmente em ambientes desfavoráveis. Como organelos altamente dinâmicos, as mitocôndrias participam na maioria das alterações que ocorrem durante a transformação neoplásica, contribuindo, por exemplo, para a capacidade de as células cancerígenas lidarem com o stresse oxidativo e escaparem à apoptose. A TRAP1 (do inglês Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1) é uma proteína mitocondrial da família HSP90, que regula tanto a reprogramação metabólica celular como a apoptose mitocondrial. A TRAP1 encontra-se frequentemente sobre-expressa em vários tipos de cancro, tal como o cancro do pulmão. A sobre-expressão desta proteína parece ser importante para a sobrevivência das células cancerígenas em condições de stress oxidativo elevado, pois inibe a morte celular mediada por espécies reativas de oxigénio (ERO). A proteína adaptadora p66Shc é outra proteína que desempenha um papel na progressão das células cancerígenas. Além de ligar recetores de superfície a vias de sinalização intracelular, é conhecida pelo seu papel pró-apoptótico através da regulação da produção de ERO mitocondrial. É de notar que os papeis da TRAP1 e p66Shc ainda não estão completamente esclarecidos e que os mecanismos subjacentes ao seu papel na bioenergética das células cancerígenas e na regulação do estresse oxidativo ainda se encontram mal caracterizados. Resultados obtidos anteriormente no nosso grupo demostraram que o silenciamento da TRAP1 nas células cancerígenas de pulmão A549 foi acompanhado por um declínio nos níveis totais de p66Shc, mas, pelo contrário, por um aumento dos níveis de uma forma ativada da p66Shc (ou seja, fosforilada na serina 36 (pSer36)). Assim, o nosso objetivo foi identificar uma possível interligação entre a TRAP1 e p66Shc na modulação do stresse oxidativo das células cancerígenas do pulmão. Para este estudo, foram utilizadas três linhas celulares de pulmão humano: a linha celular não-tumorigénica BEAS-2B e as linhas celulares tumorais A549 e H1299. Para se avaliar os efeitos do silenciamento da TRAP1 e/ou p66Shc, foram examinados parâmetros relativos ao crescimento celular, à atividade metabólica e metabolismo celular. A análise dos níveis de proteína por Western Blotting evidenciou que os níveis de TRAP1 não são modelados pelos níveis de p66Shc e vice-versa. É de ressalvar que o silenciamento simultâneo das proteínas TRAP1 e p66Shc aumentou a suscetibilidade ao fármaco antineoplásico doxorubicina das células BEAS-2B e A549. A avaliação dos níveis de stresse oxidativo feita usando-se as sondas fluorescentes H2DCFDA (stresse oxidativo geral) e MitoPY1 (peróxido de hidrogénio mitocondrial) mostrou que o aumento da suscetibilidade não estava relacionado com o aumento da produção de ERO. Adicionalmente, o efeito de silenciamento das proteínas TRAP1 e p66Shc no metabolismo celular foi avaliado através de um ensaio de Mito stress. Os resultados evidenciaram alterações importantes nos parâmetros associados à respiração mitocondrial das células não tumorais BEAS-2B, mas não das células cancerígenas do pulmão. Curiosamente, o efeito da sub-expressão da proteína p66Shc induziu uma diminuição dos níveis de proteína da enzima superóxido dismutase 1 nas células tumorais H1299, as quais, sob a mesma condição, tendem a ter uma diminuição dos níveis de ERO (embora sem significado estatístico). É de salientar que, em alguns casos, os resultados alcançados foram ou de uma única experiência ou de baixa reprodutibilidade, dificultando o estabelecimento de conclusões. Embora não tenham sido atingidos todos os objetivos inicialmente propostos, este estudo permitiu obter uma primeira visão de como diferentes tipos de células podem reagir de forma diferente à manipulação das proteínas TRAP1 e p66Shc, apoiando a ideia de que as funções da TRAP1 e p66Shc dependem do tipo de tecido/célula.

Cancer cells remodel their metabolism and energy production mechanisms to support their survival and fast proliferation, especially in unfavourable environments. As highly dynamic organelles, mitochondria take part in most changes that occur during neoplastic transformation by contributing, for instance, to the ability of cancer cells to cope with oxidative stress and escape apoptosis. Tumour Necrosis Factor Receptor-Associated Protein 1 (TRAP1) is a mitochondrial chaperone of the HSP90 family that regulates both cellular metabolic reprogramming and mitochondrial apoptosis. TRAP1 is often overexpressed in several cancers such as lung cancer. Its upregulation appears to be important for cancer cell survival under conditions of severe oxidative stress, through inhibition of reactive oxygen species (ROS)-mediated cell death. The adaptor protein p66Shc is another protein that plays an important role in cancer cell progression. Besides linking surface receptors to intracellular signalling pathways, it is known for its pro-apoptotic role through the regulation of mitochondrial ROS production. Of note, the roles of TRAP1 and p66Shc are still controversial, and the mechanisms behind their role in cancer cell bioenergetics and in the regulation of oxidative stress are still poorly characterized. Previous results from our group have shown that TRAP1 silencing in A549 lung cancer cells was accompanied by a decline in the total levels of p66Shc but an increase in the levels of activated p66Shc (i.e., phosphorylated at serine 36 (pSer36)). With this in mind, our aim was to identify the possible crosstalk between p66Shc and TRAP1 in the modulation of oxidative stress of lung cancer cells. Three human lung cell lines were used: the non-tumorigenic BEAS-2B cells and the tumoral cell lines A549 and H1299. To evaluate the effects of TRAP1 and/or p66Shc silencing, parameters of cell growth, metabolic activity, and cellular metabolism were examined. The analysis of protein levels by Western Blotting showed that TRAP1 levels were not modulated by p66Shc levels and vice-versa. Importantly, the simultaneous downregulation of TRAP1 and p66Shc increased the susceptibility to the antineoplastic doxorubicin in BEAS-2B and A549. The evaluation of oxidative stress using the fluorescent dyes H2DCFDA (general oxidative stress) and using MitoPY1 (mitochondrial H2O2) showed that the increased susceptibility was unrelated with an increase in ROS production. Additionality, the effect of TRAP1 and p66Shc silencing on the energy metabolism was assessed using a Seahorse Mito Stress assay. Data evidenced changes in mitochondrial respiration-associated parameters in non-tumoral BEAS-2B cells, but not in lung cancer cells. Interestingly, downregulation of p66Shc induced a decrease in superoxide dismutase 1 protein levels in H1299 tumoral cells which, under the same condition, also decreased ROS levels (although without statistically significant). Of note, in some cases, results were from a single experiment or lacked consistency, preventing the establishment of form conclusions. Although not achieving its goal, this study gives a brief insight of how different cell types might react differently to TRAP1 or p66Shc manipulation, further supporting the idea that TRAP1 and p66Shc roles are dependent on tissue/cell type.