Brain endothelial cells senescence-Towards brain senescence imaging

Abstract

A barreira hematoencefálica (BHE) é formada por células endoteliais cerebrais que revestem as paredes capilares. As céulas endoteliais do cérebro, juntamente com os pericitos, astrócitos, microglia e membrana basal formam a unidade neurovascular (UNV). A UNV é responsável pela homeostase cerebral. Estudos mostram que há uma deteoriação da função e a estrutura da BHE durante o envelhecimento, caracterizada por uma disfunção das células endoteliais do cérebro. A senescência celular, uma característica do envelhecimento desencadeado por uma variedade de estresses, é caracterizada por uma suspensão do ciclo celular e um fenótipo secretor distinto. Há uma acumulação destas células no cérebro durante o envelhecimento fisiológico. Infelizmente, a identificação dessas células usando plataformas de imagem não é possível atualmente.Induzimos um programa de senescência em células endoteliais cerebrais (bEND.3) por irradiação gama (10Gy) ou doxorrubicina. A senescência foi avaliada pela análise da atividade de β-Galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal) usando a sonda SPiDER-β-Gal e vários marcadores senescentes, p21, H2AX e uPAR.A internalização do marcador de Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) [18F]FPyGal, desenvolvido no Werner Siemens Imaging Center, Universidade de Tübingen, foi avaliada em células bEND.3 proliferativas e senescentes. Este marcador tem afinidade para SA-β-Gal, um marcador de senescência. Observamos uma maior internalização da sonda em células bEND.3 senescentes. Para tentar validar a senescência no cérebro, realizamos a coloração ex vivo com SPiDER-β-Gal em criossecções de murganhos envelhecidos e de modelos de doença (MD) APP/PS1, A30P4, A30P-2126 e APP23.Fizemos testes in vitro para caracterizar o tamanho e a estabilidade das microbolhas Sonovue (MBs). Na presença de ultrassons (US) as MBs foram destruídas. Um protocolo animal foi submetido na Universidade de Tübingen para analisar a internalização do traçador PET FPyGal in vivo. MBs e US serão usados para facilitar a detecção do marcador no cérebro. Este futuro estudo contribuirá para o desenvolvimento de uma ferramenta de imagem para detectar a senescência no cérebro in vivo.

The Blood-brain Barrier (BBB) is formed by brain endothelial cells (brain-ECs) that line the capillary walls. Brain-ECs, together with pericytes, astrocytes, microglia, and basement membrane form the neurovascular unit (NVU). The NVU is responsible for the maintenance of brain homeostasis. The function and structure of the BBB deteriorates during aging, characterized by a dysfunction of brain-ECs. Cell senescence, a hallmark of aging can be triggered by a variety of stresses, is characterized by a cell cycle arrest and a distinct secretory phenotype. These cells accumulate during physiological aging in the brain. Unfortunately, the identification of these cells using imaging platforms is currently not possible. We induced a senescence program in brain endothelial cells (bEND.3) by gamma radiation (10Gy) or doxorubicin. This was assessed by analysis of senescence associated β-Galactosidase (SA-β-Gal) activity using SPiDER-β-Gal probe and various senescent markers, p21, H2AX and uPAR. The internalization of the Positron Emission Tomography (PET) tracer [18F]FPyGal, developed at Werner Siemens Imaging Center, University of Tübingen was assessed in proliferative and senescent bEnd.3 cells. This tracer has affinity for SA-β-Gal a hallmark of senescence. We observed a higher internalization of the probe in senescent bEND.3 cells. To validate senescence in the brain we performed ex vivo staining with SPiDER-β-Gal in cryosections of aged wild type mice and models of disease (DM), A30P4, A30P-2126, APP/PS1 and APP23 mice. We have done in vitro tests to characterize size and stability of Sonovue microbubbles (MBs). In the presence of ultrasounds (US), MBs were destroyed. An animal protocol was submitted in the University of Tübingen to analyze in vivo the internalization of the PET tracer FPyGal. MBs and US will be used to facilitate the detection of the tracer in the brain. This study will be performed in the near future at the University of Tübingen and will contribute for the development of an imaging tool to detect senescence in the brain in vivo.