Deciphering the molecular mechanisms that mediate postsynaptic maturation

Abstract

In the mouse primary somatosensory cortex or barrel cortex, thalamocortical axons (TCAs) conveying sensory information from the whiskers selectively synapse onto excitatory layer IV neurons in a topographic fashion as discrete neuronal modules or "barrels". Despite its well-characterized circuitry, the molecular mechanisms mediating synaptic connectivity between TCAs and layer IV neurons are poorly understood. Importantly, proper maturation of the postsynaptic compartment is of key importance for critical period plasticity and fine-tuning the orderly organisation of cortical barrels.The host lab showed that the postsynaptic G protein-coupled receptor GPR158, a recently identified key regulator of hippocampal synapse formation and function, is strikingly enriched in layer IV neurons of the developing barrel cortex. Here, GPR158 contributes to dendritic spine maturation, but the signalling mechanisms employed by GPR158 to instruct postsynaptic maturation are not known. Using an unbiased protein-protein interaction screen, the host lab identified PLCXD2, an atypical phospholipase C with no known function in the brain, as a novel intracellular GPR158 interactor. In this thesis project, we characterized the spatiotemporal expression profile of Gpr158 and Plcxd2, showing co-expression in individual layer IV pyramidal neurons of the barrel cortex. Interestingly, during a well-defined window of spinogenesis, Gpr158 expression increases profoundly while Plcxd2 expression reaches a plateau. Next, using sparse CRISPR/Cas9-mediated epitope tagging in postmitotic neurons we reveal the postsynaptic localization of endogenous PLCXD2. Lastly, we assessed the contribution of PLCXD2 to dendritic spine development and observed a trend towards more mature, mushroom-type spines in barrel neurons lacking PLCXD2. Together, these findings uncover a novel postsynaptic GPR158-PLCXD2 signalling complex regulating dendritic spine maturation.

No córtex somatossensorial primário de ratinho, também conhecido como córtex em barril, a informação sensorial proveniente dos bigodes é transmitida por projeções talamocorticais, as quais estabelecem sinapses exclusivamente com neurónios excitatórios da camada cortical IV de forma topográfica e organizada em módulos conhecidos como “barris”. Este circuito neuronal encontra-se extensivamente caracterizado na literatura, no entanto, os mecanismos moleculares que medeiam a conectividade sináptica entre projeções talamocorticais e neurónios da camada IV não são completamente conhecidos. O desenvolvimento dos barris corticais depende, em grande medida, da maturação do compartimento pós-sináptico, a qual permite o refinamento da organização dos barris e a plasticidade das conexões sinápticas. O recetor acoplado à proteína G, GPR158, foi previamente caracterizado pelo laboratório anfitrião como sendo importante para a formação e funcionamento de sinapses no hipocampo. No entanto, este recetor é também expresso especificamente por neurónios da camada cortical IV durante o desenvolvimento do córtex em barril. Nesta região, GPR158 contribui para a maturação de espículas dendríticas, mas os mecanismos de sinalização celular envolvidos neste processo não são conhecidos. Através de um ensaio de interação entre proteínas, o laboratório anfitrião identificou uma nova interação intracelular entre GPR158 e PLCXD2, uma fosfolipase do tipo C bastante atípica e sem função conhecida no cérebro. Neste projeto de dissertação de mestrado, caracterizámos a expressão espaciotemporal de Gpr158 e Plcxd2 no córtex em barril e demonstrámos que ambos são co-expressos em neurónios da camada IV. No período de desenvolvimento caracterizado por intensa génese de espículas dendríticas, a expressão de Gpr158 aumenta profundamente, enquanto a expressão de Plcxd2 atinge um plateau. Posteriormente, usámos uma estratégia mediada por CRISPR/Cas9 para marcação de epítopos em neurónios pós-mitóticos, a qual revelou a localização pós-sináptica de PLCXD2 expressa de forma endógena. Por fim, avaliámos a contribuição de PLCXD2 no desenvolvimento de espículas dendríticas e observámos uma tendência para a presença de espículas em forma de cogumelo, consideradas mais maduras, em neurónios da camada cortical IV que não expressavam PLCXD2. Coletivamente, estas observações revelam a existência de um novo complexo de sinalização pós-sináptico, GPR158-PLCXD2, envolvido na regulação da maturação de espículas dendríticas.