POTENCIAL TERAPÊUTICO DE INIBIDORES DO NRF2 NA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA EM ASSOCIAÇÃO COM O IBRUTINIB ESTUDOS IN VITRO

Abstract

A leucemia linfocítica crónica (LLC) é o tipo de leucemia mais comum nos países ocidentais, sendo mais prevalente em homens. Várias alterações genéticas podem ser encontradas nesta patologia, desde alterações cromossómicas, alterações na expressão de miRNAs, mutações somáticas e modificações epigenéticas. O stresse oxidativo, que resulta do desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio (ROS/RNS) e as defesas antioxidantes, em favor das primeiras, parece também desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento desta doença. A via NRF2-KEAP1 é o principal mecanismo de resposta antioxidante e citoprotetora contra as ROS. Esta via de sinalização celular apresenta um duplo papel no cancro – por um lado previne o desenvolvimento tumoral e por outro, após o estabelecimento da neoplasia, pode proteger as células tumorais dos agentes terapêuticos conduzindo a resistência ao tratamento. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico de dois inibidores do NRF2, o brusatol e o ML385, em monoterapia e em associação com o ibrutinib (um inibidor da tirosina cinase de Bruton), num modelo in vitro de LLC, a linha celular HG-3.Em primeiro lugar, os níveis de expressão dos genes NFE2L2 (codifica o NRF2) e KEAP1 (codifica o KEAP1) foram avaliados por qPCR, na linha celular HG-3. Seguidamente, as células HG-3 foram incubadas, durante 72 horas, na ausência e na presença de concentrações crescentes de brusatol, ML385 e ibrutinib, em monoterapia e em combinação. A atividade metabólica foi avaliada através do ensaio da resazurina. Uma vez que o brusatol demonstrou maior potencial terapêutico na LLC, em monoterapia e em combinação com o ibrutinib, estudaram-se os mecanismos moleculares subjacentes a estes esquemas terapêuticos. Para avaliar o tipo de morte celular utilizou-se a técnica de citometria de fluxo (CF), através da dupla marcação Anexina V e 7-amino-actinomicina D (7-AAD) e por análise morfológica através da coloração de May-Grünwald Giemsa. O ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo através da utilização da solução iodeto de propídio (PI)/RNAse. De modo a avaliar o potencial da membrana mitocondrial recorreu-se à citometria de fluxo, em que se utilizou a sonda JC-1. Os níveis intracelulares de peróxidos, ROS com origem mitocondrial, anião superóxido, óxido nítrico e glutationa reduzida foram analisados por citometria de fluxo com recurso às sondas fluorescentes, DCFH2-DA, DHR-123, DHE, DAF-FM DA e MO, respetivamente. Por fim foram avaliados os níveis de expressão dos genes KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 e GPX1, que são regulados pela proteína NRF2, pela técnica de qPCR. Os resultados foram analisados tendo em consideração um nível de significância de 95% (p<0,05).Os resultados demonstraram que as células HG-3 expressavam ambos os genes que codificam as proteínas KEAP1 e NRF2. O brusatol e o ML385 reduziram a atividade metabólica das células HG-3 de forma dependente da dose e do tempo. No entanto esta linha celular revelou ser mais sensível ao brusatol, sendo o valor do IC50 às 48 horas de incubação, aproximadamente, 110 nM para o brusatol e de 500 µM para o ML385. A combinação do brusatol (50 nM) com o ibrutinib (0,5 µM) revelou ser bastante eficaz, sendo a redução dos níveis da atividade metabólica maior que a soma dos efeitos individuais dos fármacos (efeito sinérgico), às 48 e 72 horas de incubação (37% e 37% para a combinação, 67% e 57%, para o brusatol em monoterapia e 79% e 74% para o ibrutinib em monoterapia, respetivamente). Por outro lado, a combinação entre o ML385 (2,5 µM) e ibrutinib (0,5 µM) não demonstrou ser tão eficaz sendo a redução da atividade metabólica das células HG-3 inferior à soma dos efeitos individuais dos fármacos em todos os tempos de incubação.O brusatol em monoterapia e em combinação terapêutica com ibrutinib induziu efeito citotóxico e citostático. A morte celular foi mediada, sobretudo, por apoptose e observou-se um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. Além disso, o brusatol, em monoterapia e em associação com o ibrutinib, diminuiu o potencial da membrana mitocondrial em comparação com o controlo, confirmando que estas estratégias terapêuticas induzem morte por apoptose. Pela análise de espécies reativas de oxigénio (peróxidos intracelulares, anião superóxido e ROS com origem mitocondrial), de nitrogénio (óxido nítrico) e da glutationa reduzida determinou-se que o brusatol em monoterapia e em combinação com o ibrutinib, induziram aumento das ROS/RNS e diminuição da GSH. Este resultado foi confirmado pelo aumento da razão ROS/GSH. No entanto, o tratamento com brusatol não parece influenciar a expressão dos genes envolvidos na via de sinalização do NRF2 (KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 e GPX1).Em conclusão, este estudo permitiu elucidar que o brusatol poderá ser um potencial agente farmacológico para a terapêutica da LLC, em monoterapia e como coadjuvante do tratamento com ibrutinib.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the commonest leukemia in Western Countries being more prevalent in men. Various genetic alterations can be found in this pathology, including chromosomic alterations, miRNA alterations, epigenetic changes, and somatic mutations.Oxidative stress, which results from the disequilibrium between reactive oxygen species/ reactive nitrogen species (ROS/RNS) production and antioxidant defenses, seems also to play a crucial role in the development of this disease. The NRF2-KEAP1 pathway is the principal mechanism of antioxidant and cytoprotective response against ROS. This pathway presents a dual role in cancer – can prevent tumor development and, after tumor establishment, can protect the tumor cells from therapeutic agents leading to treatment resistance.The aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of two NRF2 inhibitors, brusatol and ML385, in monotherapy and association with ibrutinib (Bruton tyrosine kinase inhibitor used in clinical practice for CLL treatment), in an in vitro CLL model, the HG-3 cell line.The expression levels of NFE2L2 (which encodes NRF2) and KEAP1 (which encodes KEAP1) genes were initially evaluated in the HG-3 cells, using the qPCR. Then, the HG-3 cells were incubated, for 72 hours, in the absence and presence of increasing concentrations of brusatol, ML385, and ibrutinib in monotherapy and association. The metabolic activity was determined by resazurin assay. Since brusatol has shown greater therapeutic potential in CLL, as monotherapy and in combination with ibrutinib, the molecular mechanisms underlying these therapeutic schedules were studied. The type of cell death was analyzed by optical microscopy (May-Grünwald Giemsa staining) and by flow cytometry (FC), using the annexin V (AV) and 7- AAD double staining. The cell cycle was evaluated by flow cytometry using the propidium iodide (PI)/RNAse solution. The mitochondrial membrane potential was quantified by FC using JC-1probe. Intracellular peroxides, mitochondrial ROS, superoxide anion, nitric oxide and reduced glutathione levels were measured by fluorimetry using DCFH2-DA, DHR-123, DHE, DAF-FM DA and MO fluorescent probes, respectively. Finally, the levels of gene expression of KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 and GPX1, which are regulated by NRF2 protein, were assessed using qPCR. Results were analyzed statistically considering a 95% significance level (p<0.05).The results showed that HG-3 cells express NFE2L2 and KEAP1 genes. The exposure to increasing concentrations of brusatol and ML385 induced reduced metabolic activity depending on concentration and time. However, this cell line proved to be more sensitive to brusatol, being the IC50 value at 48 hours of incubation, approximately, 110 nM for Brusatol and 500 µM for ML385. The association of brusatol (50 nM) with ibrutinib (0.5 µM) showed a synergic effect at 48 and 72 hours (37% and 37% for the combination, 67% and 57%, for brusatol in monotherapy and 79% and 74% for ibrutinib in monotherapy, respectively), leading to a higher reduction of metabolic activity than drugs alone. On the other hand, the combination between ML385 (2.5 µM) and Ibrutinib (0.5 µM) did not prove to be as effective, with the reduction in the metabolic activity of HG-3 cells being less than the sum of the individual drug effects at all incubation times. Brusatol in monotherapy and in association with ibrutinib induce a cytostatic and cytotoxic effect. The cell death was mediated, mainly, by apoptosis, and it was observed cell cycle arrest in phase G0/G1. Besides that, cells treated with both conditions showed a decrease in the mitochondrial membrane potential. Our results suggest that brusatol could be a potential pharmacological agent for the therapeutic of CLL, in monotherapy and as an adjuvant to treatment with ibrutinib, confirming that these therapeutic strategies induce mitochondrial dysfunction, which may contribute to cell death by apoptosis. By the analysis of reactive oxygen species (peroxides, mitochondrial ROS and superoxide anion), nitrogen (nitric oxide) and reduced glutathione it was determined that Brusatol, in monotherapy and in association with ibrutinib led to an increase in free radicals and a decrease in GSH. This result indicates that the cell death induced by Brusatol, in monotherapy and in association with Ibrutinib, was mediated by inducing oxidative stress. The induction of oxidative stress was confirmed by the increase in the ROS/GSH ratio. However, brusatol treatment does not seem to influence the expression of genes involved in the NRF2 signaling pathway (KEAP1, NF-κB1, NQO1, TXNRD1, HMOX1 and GPX1). In conclusion, this study allowed us to elucidate that brusatol could be a potential pharmacological agent for the therapy of CLL, in monotherapy and as an adjunct to treatment with ibrutinib.