TARPs as new modulators of M-channels

Abstract

A família de genes KCNQ codifica as subunidades dos canais de potássio Kv7, canais de potássio dependentes de voltagem de baixo threshold, não-inativantes que regulam a excitabilidade neuronal. As correntes M geradas por estes canais são responsáveis pela repolarização da membrana após um potencial de ação. Existem 5 subtipos de canal Kv7, Kv7.1-5. A subunidade Kv7.1 é predominantemente expressa no coração, Kv7.4 nas células sensoriais e Kv7.2, Kv7.3 e Kv7.5 estão presentes no cérebro. Os canais M heteroméricos Kv7.2/Kv7.3 são os predominantes, mas os canais homoméricos Kv7.2/Kv7.2 geram também correntes M em algumas partes do cérebro. Mutações no gene KCNQ2 são um grande fator de risco para epilepsia de início precoce, transtorno bipolar e formas leves a graves de deficiência intelectual. Como os canais Kv7.2 têm um papel fundamental no controlo da excitabilidade e muito pouco se sabe sobre como as correntes M são reguladas, a procura para descobrir novas abordagens para potenciar os canais M tem vindo a crescer.O nosso laboratório recentemente identificou um novo interator do canal Kv7.2, a stargazina, que é conhecida como uma proteína reguladora do tráfego intracelular e sináptico de recetores de glutamato do tipo AMPA. Os nossos dados suportam uma interação funcionalmente relevante entre o canal Kv7.2 e esta proteína sináptica. A stargazina pertence à família das proteínas transmembranares reguladoras dos recetores AMPA (TARPs). As proteínas do grupo das TARPs do tipo I, do qual a stargazina é um membro, partilham uma alta homologia estrutural e funcional. Portanto, neste projeto, explorámos a hipótese de outras TARPs do tipo I poderem também interagir com o Kv7.2 e regular a sua função.Ao realizar um teste de imunoprecipitação, identificámos dois novos interatores do canal Kv7.2, TARP-γ3 e TARP-γ8. Além disso, os dados obtidos através de um ensaio de ligação de proximidade in situ (PLA) revelaram que estas duas proteínas interagem com o Kv7.2 em dendrites de neurónios de hipocampo. Também descobrimos que a co-expressão de Kv7.2 com TARP-γ3 ou stargazina mas não com TARP-γ8 aumenta os níveis superficiais de Kv7.2, o que indica que diferentes membros desta família de proteínas podem ter diferentes papéis no tráfego do canal Kv7.2. Finalmente avaliamos se o estado da fosforilação da stargazina modula a sua interação com o Kv7.2. Os nossos resultados revelam que o estado da fosforilação desta proteína é importante para que a interação entre estas duas proteínas possa ocorrer e afeta a regulação do tráfego celular de Kv7.2.No seu conjunto, este trabalho revelou novos interatores do canal Kv7.2, e apoia a existência de papéis diferentes para diferentes membros das TARPs do tipo I na regulação do tráfego celular do canal Kv7.2.

The KCNQ gene family encodes Kv7 potassium channel subunits, which are low-threshold, non-inactivating, voltage-gated potassium channels that regulate neuronal excitability. The M-current generated by these channels is responsible for membrane repolarization after repetitive firing. There are 5 subunits of Kv7, Kv7.1-5. Kv7.1 is predominantly expressed in the heart, Kv7.4 in primary sensory cells and Kv7.2, Kv7.3 and Kv7.5 are present in the brain. The heteromeric Kv7.2/Kv7.3 M-channel is the most predominant in the brain, but Kv7.2/Kv7.2 homomeric channels generate M-currents in some brain areas. Mutations in the KCNQ2 gene are a high-risk factor for early-onset epilepsy, bipolar disorder, and mild to severe forms of intellectual disability. As Kv7 channels play a pivotal role in the control of neuronal excitability and very little is known about how M-currents are regulated, the pursuit to discover new approaches to potentiate the M-channels’ function has been growing. Our laboratory has recently identified a new interactor of Kv7.2, stargazin, which is well-known as a regulator of intracellular and synaptic traffic of AMPA-type glutamate receptors. Our data support a functionally relevant interaction between Kv7.2 and this synaptic protein. Stargazin belongs to the transmembrane AMPA receptor regulatory proteins (TARPs) family. The group of type I TARPs, of which stargazin is a member, share a high structural and functional homology. Therefore, in this work, we explored the hypothesis that other type I TARPs may also interact with Kv7.2 and regulate its function. By performing an immunoprecipitation assay, we identified two new interactors of the Kv7.2 channel, TARP-γ3 and TARP-γ8. Moreover, the data we obtained using an in situ Proximity Ligation Assay (PLA) revealed that these two proteins also interact with Kv7.2 in the dendrites of hippocampal neurons. Furthermore, we found that co-expression of Kv7.2 with TARP-γ3 or stargazing, but not with TARP-γ8, increases the surface levels of Kv7.2, indicating that different members of this protein family may have different roles in controlling the trafficking of the Kv7.2 channel. Finally, we evaluated whether stargazin phosphorylation status modulates its interaction with Kv7.2. Our results revealed that the phosphorylation status of this protein is important for the interaction between the two proteins to occur and affects the regulation of Kv7.2 cell trafficking. Overall, this work unveiled new interactors of the Kv7.2 channel, supporting differential roles for different type I TARP members in regulating the Kv7.2 channel cellular trafficking.