Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/101681
Title: Deadly delivery: unraveling the contribution of microglial exosomes to retinal degeneration in glaucoma
Authors: Aires, Inês Sofia Dinis
Orientador: Santiago, Ana Raquel
Pereira, Paulo
Keywords: Microglia; exossomas; vesículas extracelulares; glaucoma; retina; inflamação; neurodegeneração; Microglia; exosomes; extracellular vesicles; glaucoma; retina; inflammation; neurodegeneration
Issue Date: 20-Jul-2022
Project: This work was supported by Foundation for Science and Technology (FCT), Portugal PhD fellowship (PD/BD/127821/2016), Strategic Projects (UID/NEU/04539/2013, UID/ NEU/04539/2019, UIDB/04539/2020 and UIDP/04539/2020); COMPETE-FEDER (FCOMP-01- 0124-FEDER-028417, and POCI-01-0145-FEDER-007440); Centro 2020 Regional Operational Programme (CENTRO-01-0145-FEDER-000008: BRAINHEALTH 2020); Banco Santander Totta (grant FMUC-BST-2016-224). Proteomic analysis was supported by EPIC-XS, project number 823839, funded by the Horizon 2020 programme of the European Union. The authors would also like to thank iLAB – Microscopy and Bioimaging Lab, Faculty of Medicine of University of Coimbra, a node of PPBI (Portuguese Platform of BioImaging, POCI-01-0145-FEDER-022122). 
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: No sistema nervoso central as células da microglia são as principais responsáveis pela resposta imune e são importantes reguladoras da homeostasia, inspecionando o parênquima para identificar alterações na função neuronal. O glaucoma é uma doença degenerativa da retina, caracterizada pela perda de células ganglionares da retina (CGR) e atrofia do nervo ótico, sendo o principal fator de risco para o desenvolvimento da doença o aumento da pressão intraocular (PIO). A neuro-inflamação crónica mediada pelas células da microglia desempenha um papel central no glaucoma e pode ocorrer no início do curso da doença, mesmo antes de serem detetadas alterações no número de CGR, iniciando-se na cabeça do nervo ótico e progredindo ao longo do parênquima da retina. No cérebro foi demonstrado que as células da microglia estão envolvidas numa forma de comunicação eficiente entre células, sendo capazes de disseminar o sinal inflamatório entre células vizinhas e/ou distantes, através de vesículas extracelulares (VEs). Recentemente, no centro deste sistema de comunicação uma população específica de pequenas VEs derivadas da via endocítica, conhecidas como exossomas, tem mostrado ter grande relevância. Sabendo que no glaucoma a reatividade das células da microglia progride da região central da retina para a periferia do parênquima, podemos antecipar a existência de uma forma regulada e altamente eficiente de comunicação entre estas células. Neste trabalho explorámos o papel dos exossomas da microglia no contexto do glaucoma. Células da microglia (BV-2 uma linha celular de microglia de murganho ou microglias primárias de retina de rato) foram expostas a pressão hidrostática elevada (PHE) para simular o aumento da PIO. Anteriormente, utilizando este modelo experimental, mostrámos que a exposição a EHP leva a um aumento da resposta inflamatória das células da microglia com consequências nefastas para os neurónios da retina. Para desvendar a contribuição dos exossomas da microglia para a neuro-inflamação, células da microglia foram expostas a PHE e os exossomas libertados foram isolados por ultracentrifugação sequencial e caracterizados em tamanho, forma, número e presença de proteínas envolvidas na sua biogénese (Capítulo 2). Células da microglia naïve foram incubadas com os exossomas isolados e foram analisadas alterações no seu estado de ativação. Detetámos um aumento no perfil pro-inflamatório das células da microglia após exposição a exossomas isolados de microglias expostas a PHE (Exo-PHE), com um pronunciado aumento da eficiência fagocítica e motilidade. Adicionalmente, a exposição de culturas neuronais primárias de retina a Exo-PHE promoveu stress oxidativo e morte neuronal. Para desvendar o conteúdo dos exossomas libertados pelas células da microglia foi realizado um estudo do proteoma destas vesículas (Capítulo 3). A análise dos resultados permitiu-nos não só confirmar a origem exossomal da população de VEs, mas também detetar um enriquecimento em proteínas envolvidas na sinalização da resposta inflamatória e no processamento de ácido ribonucleico (ARN) nos Exo-PHE. Adicionalmente, a presença de microARNs envolvidos na sinalização da resposta inflamatória e neurodegeneração nos exossomas da microglia também foi avaliado (Capítulo 3). Os Exo-PHE apresentam um aumento na presença de microARNs que modulam a ativação do fator nuclear kappa B (NF-κB) e da via de sinalização do Wnt. Para aprofundar o conhecimento dos efeitos neurodegenerativos dos exossomas das células da microglia, estas vesiculas foram injetadas no vítreo de murganhos C57BL/6J na presença ou ausência de células residentes da microglia da retina (Capítulo 4). Os exossomas injetados no vítreo parecem acumular-se nas células da microglia residentes da retina na camada das CGR. A administração intravítrea dos Exo-PHE causou a um ambiente inflamatório generalizado, com um aumento da expressão de mediadores pro-inflamatórios, infiltração de células imunes periféricas e quebra da barreira hemato-retiniana, morte celular e perda de CGR. Todos estes efeitos foram acompanhados por reatividade macroglial, com alteração na distribuição dos astrócitos e expressão de proteína fibrilar ácida da glia (GFAP) ao longo dos processos das células de Müller. A depleção das células da microglia da retina através da incorporação de PLX5622, um inibidor seletivo da quinase do recetor do fator 1 estimulador de colônias (CSF-1R), na alimentação dos murganhos, conteve a neuro-inflamação induzida pelos Exo-PHE. Especificamente, a ausência das células da microglia da retina reduziu o ambiente pro-inflamatório, preveniu a infiltração de células imunes periféricas e a morte das células da retina. No entanto, não foi capaz de impedir a perda de CGR. Neste estudo, revelamos uma nova forma de comunicação entre as células da microglia, desvendando potenciais mecanismos responsáveis pela propagação da neuro-inflamação no glaucoma e abrindo novas perspetivas para o desenvolvimento de terapias que concedam proteção aos neurónios da retina, através do controlo da disseminação da resposta neuro-inflamatória pelos exossomas da microglia.
Microglial cells are the resident immune cells of the retina and act as important regulators of homeostasis taking part in the screening for potential threats to neuronal function. Glaucoma is a retinal degenerative disease characterized by retinal ganglion cell (RGC) dysfunction and optic nerve atrophy, and increased intraocular pressure (IOP) is the main risk factor for disease onset. This disease is often accompanied by a dysregulated pro-inflammatory response by retinal microglial cells. The onset of the neuroinflammatory milieu can occur even before detectable alterations in RGC number, starting at the optic nerve head and further progressing along the retinal parenchyma. In the brain microglial cells were shown to engage a highly efficient route for cell-to-cell communication, being able to spread the neuroinflammatory signal between neighboring and distant cells, through extracellular vesicles (EVs). Recently, increasing attention has been given to a specific population of small EVs derived from the endocytic pathway, known as exosomes. Given that in glaucoma microglia reactivity spreads from the central region of the retina to the more distant tissue in a highly organized sequential fashion, a regulated form of cell communication may be envisaged. Herein, we uncovered the role of microglia exosomes in the context of glaucoma. To mimic elevated IOP, an in vitro model using elevated hydrostatic pressure (EHP) was used. Previously, we have demonstrated, using this model, that EHP leads to exacerbated microglia response with deleterious effects for retinal neurons. To unravel the contribution of microglial exosomes to neuroinflammation microglial cells (either BV-2 murine microglia cell line or primary rat retinal microglia) were exposed to EHP and exosomes were isolated by sequential ultracentrifugation and characterized in size, shape, number and presence of proteins involved in their biogenesis (Chapter 2). The isolated vesicles were then incubated with naïve microglial cells to assess alterations in cell reactivity. We detected an increased microglia pro-inflammatory profile following exposure to exosomes derived from microglia under EHP (Exo-EHP), with increased phagocytic activity and motility. In addition, the exposure of primary retinal neuronal cell cultures to Exo-EHP triggered oxidative stress and retinal cell death. To unravel the content of microglia exosomes a comprehensive proteomic analysis was performed in the isolated vesicles (Chapter 3). The analysis of the data not only confirmed the exosomal origin of our EVs population but also revealed an enrichment in proteins associated with inflammatory signaling and ribonucleic acid (RNA) processing in Exo-EHP. In addition, the presence of miRNAs involved in inflammation and neurodegeneration signaling in microglia exosomes was also investigated (Chapter 3). Exo-EHP were enriched in miRNAs that modulate nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) activation and Wnt signaling. To further clarify the neurodegenerative potential of microglial exosomes these vesicles were injected intravitreally into C57BL/6J mice in the presence or absence of resident retinal microglia (Chapter 4). Interestingly, exosomes injected intravitreally seem to accumulate in resident retinal microglial cells in the RGC layer. The intravitreal injection of Exo-EHP promoted an overall neuroinflammatory environment, with increased expression of pro-inflammatory mediators, peripheral immune cell infiltration with blood-retinal-barrier breakdown, cell death and loss of RGCs. All these effects were accompanied by macroglia reactivity with altered distribution of astrocytes and expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) along Müller cell processes. The depletion of retinal microglia by incorporating PLX5622, a selective colony-stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) kinase inhibitor in mice chow, halted retinal neuroinflammation induced by Exo-EHP. Specifically, the lack of microglial cells reduced the pro-inflammatory milieu, prevented immune cell infiltration and retinal cell death. However, it was unable to hinder RGC loss. Herein, we revealed a new route of communication between retinal microglia, opening new perspectives for the development of therapies that may afford protection to retinal neurons by impairing microglia neuroinflammation spreading through exosomes.
Description: Tese de Doutoramento do Programa Interuniversitário de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/101681
Rights: embargoedAccess
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FMUC Medicina - Teses de Doutoramento

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