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Title: Neuromodulatory and neuroprotective roles of synaptic P2 receptors
Other Titles: Papel neuromodulador e neuroprotector dos receptores P2 sinápticos
Authors: Rodrigues, Ricardo Jorge Alves 
Orientador: Cunha, Rodrigo
Keywords: Receptores P2 sinápticos
Issue Date: 23-Sep-2007
Abstract: In the central nervous system (CNS), ATP is released in a vesicular manner from nerve terminals in a frequency-dependent manner. Once in the extracelular milieu ATP can activate either metabotropic P2Y (P2YR) or ionotropic P2X receptors (P2XR), which are widely expressed and distributed in the brain, namely in the hippocampus. However the role of central P2 receptors remains ill defined. By analogy with the well stablished neurotransmitter role of ATP in the peripheral nervous system, it has been assumed that ATP would also be a fast neurotransmitter in CNS. However, an ATPergic contribution to synaptic transmission could only been demonstrated in few central synapses. This led to the hypothesis that ATP acts principally as a neuromodulator in the brain, in particular with a presynaptic locus of action. This hypothesis would reconcile the heavy expression and the robust density of P2 receptors in central neurons, with the difficulty of ascribing a clear role for ATP as a fast neurotransmitter in the brain. To test this hypothesis purified nerve terminals were used (which allows isolating presynaptic effects) to assess whether P2 receptors could presynaptically control the evoked release of neurotransmitters. It is shown that ATP analogues biphasically modulate the evoked release of glutamate from purified nerve terminals of the rat hippocampus, the facilitation being mediated by P2X1,2/3,3 (antagonized by NF023) and the inhibition by P2Y1,2,4 (antagonized by reactive blue 2, MRS2179 and mimicked by Ins47953) receptors. The combination of single cell RT-PCR analysis of rat hippocampal pyramidal neurons, Western blot analysis of purified presynaptic active zone fraction and immunocytochemical analysis of glutamatergic terminals further re-enforced that the P2 receptors expressed in glutamatergic neurons, located in the active zone and in glutamatergic terminals were precisely P2X1,2,3 and P2Y1,2,4. Thus, this study demonstrates that P2 receptors are present and act presynaptically as modulatory system capable to control neurotransmitter release. The identification and characterisation of a neuromodulatory role of synaptic P2 receptors, together with the known massive release of ATP into the extracelular space upon a noxious insult led to the investigation of a possible pathophysiological role of P2 receptors in the most common chronic neurodegenerative disease Alzheimer’s disease that is believed to be initially due to subtle alterations of cortical and hippocampal synaptic efficacy prior to frank neuronal degeneration. Synapses seem to be the primordial target to the toxic Aβpeptides leading to a synaptic failure that underlies the mnemonic impairment. Thus, a major lead for the development of novel therapeutics strategies for AD is the search of mechanisms able to prevent this early synaptotoxicity caused by Aβ 1-42, which led to the investigation of a possible involvement of P2 receptors. Pharmacological blockade of P2Y1 receptors in rat hippocampal neurons prevented the neuronal death caused by the exposure to Aβ1-42. Interestingly, the blockade of P2Y1 receptors also prevents the early synaptotoxicity caused by Aβ1-42 that precedes the subsequent neuronal death. This protective role of P2Y1 receptors was also observed in vivo. In rodents, the intracerebroventricular administration of Aβ1-42 caused a decrease of the density of nerve terminals in the hippocampus and a mnemonic impairment in the absence of hippocampal neuronal death, which was not present in mice deficient in P2Y1 receptor. Furthermore, Aβ1-42 administration increased P2Y1 receptors density selectively at the synaptic level. These results demonstrate that the synaptic P2Y1 receptors are involved and mandatory in order for Aβpeptides to cause their neurotoxic effects. This prompts P2Y1 receptor antagonists as potential candidates to arrest the evolution of Alzheimer´s disease, in particular at the early onset of this neurodegenerative disease. It was also concluded that presynaptic P2 receptors functionally interact with other neuromodulatory systems, namely that operated by nACh receptors. Both immunocytochemical analysis and microfluorimetric [Ca2+]i measurements showed that P2XR and nAChR are colocalised in a subset of rat hippocampal nerve terminals and neurochemical studies allowed defining pharmacologically a functional interaction between P2X and nACh in the control of neurotransmitter release. This is mostly concluded by the observation of a cross-antagonism between P2X and nACh receptors in the control of hippocampal glutamate release, which involves P2X1, P2X2/3, P2X3 receptors and α 3& #946; 2 receptors. This promiscuous role of P2X receptors was further re-enforced by the existence of a hybrid P2X2/NR2B receptor explored by investigating a possible interaction between P2X and Nmethyl- D-aspartate (NMDA) receptors. However, this study fitted into a broader objective to gather data supporting the existence of hybrid ionotropic receptors composed by subunits from different families of receptors. NR2B binds glutamate but cannot form a channel alone. However, in HEK293 cells the co-expression of P2X2 rescued NR2B function. Furthermore, it is shown that the [Ca2+] transients elicited by NMDA receptors in cells co-expressing P2X2 and NR2B subunits are insensitive to Mg2+, are independent of glycine and are abolished by the presence of PPADS and D-AP5, selective antagonists of P2 and NMDA receptors, respectively. Co-immunoprecipitation assays also showed a physical interaction between P2X2 and NR2B, both in transfected HEK293 cells and also in mouse brain homogenate. These results provide for the first time evidences for the existence of hybrid P2X2/NR2B receptors composed by subunits from different families of receptors, which constitutes a new concept of receptor signalling. Overall, this thesis provides evidence supporting a presynaptic neuromodulatory role for ATP P2 receptors in the brain, in particular in the hippocampus. ATP biphasically modulates the release of neurotransmitters through P2Y and P2X receptors. These P2X receptors are promiscuous proteins that interact with and control other ionotropic receptors such as nACh and NMDA receptors. Albeit the physiological role of P2 receptors remains to be more throughfully explored, it was found that P2Y1 receptors blockade prevented neuronal damage and memory loss in models of Alzheimer’s disease. This indicates a pathophysiological role of ATP, prompting P2Y1 receptors antagonists as potential candidates to arrest the evolution of Alzheimer’s disease.
No sistema nervoso central (SNC), o ATP é libertado exocitoticamente de uma forma dependente da frequência. Extracelularmente, o ATP pode activar quer receptores metabotrópicos P2Y, quer receptores ionotrópicos P2X, que são receptores abundantemente expressos no cérebro, nomeadamente no hipocampo. No entanto, o papel dos receptores P2 no SNC permanece por determinar. Por analogia com o papel bem definido do ATP como neurotransmissor no sistema nervoso periférico, assumiu-se que o ATP podia ter também um papel como neurotransmissor no SNC. Contudo, uma contribuição do ATP para a transmissão sináptica apenas foi demonstrada em algumas sinapses. Esta observação conduziu à hipótese de que o ATP deverá actuar principalmente como neuromodulador no cérebro, em particular ao nível pré-sináptico. Para testar esta hipótese utilizou-se como modelo experimental terminais nervosos purificados, os quais permitem isolar os efeitos pré-sinápticos, para testar se a activação dos receptores P2 controla pré-sinapticamente a libertação estimulada de glutamato de terminais nervosos de hipocampo de rato. É demonstrado que análogos do ATP modulam de um modo bifásico a libertação estimulada de glutamato de terminais nervosos de hipocampo de rato, sendo a facilitação mediada pelos receptores P2X1,2/3,3 (efeito antagonizado pelo NF023) e a inibição pelos receptors P2Y1,2,4 (efeito antagonizado pelo reactive blue 2 e MRS2179 e mimetizado por Ins47953). A combinação da análise por RT-PCR de célula única de neurónios piramidais de hipocampo de rato, da análise por Western blot de uma fracção contendo as proteínas pré-sinápticas presentes na zona activa e da análise por imunocitoquímica dos terminais glutamatérgicos de hipocampo de rato revelou que os receptores P2 expressos pelos neurónios glutamatérgicos, localizados na zona activa e em terminais glutamatérgicos são precisamente P2X1,2,3 e P2Y1,2,4. Estes resultados demonstram que os receptores P2 estão localizados pré-sinapticamente e a sua activação modula a libertação de neurotransmissores. A identificação e caracterização de um papel neuromodulador dos receptores P2 sinápticos, conjuntamente com o facto de ocorrer uma libertação elevada de ATP para o espaço extracelular após um evento citotóxico levou ao estudo de um possível envolvimento dos receptores P2 na doença neurodegenerativa crónica mais comum, a doença de Alzheimer, cuja etiopatologia é caracterizada inicialmente por alterações ao nível sináptico no córtex e hipocampo, que ocorre antes da observação de morte neuronal. As sinapses aparentam ser os alvos primordiais dos péptidos Aβ, os quais se presume serem os principais agentes tóxicos na doença de Alzheimer, causando um mau funcionamento das sinapses o qual é responsável pelo déficit cognitivo. Deste modo, a principal estratégia no desenvolvimento de terapias para a doença de Alzheimer consiste na descoberta de mecanismos capazes de prevenir a sinaptotoxicidade inicial causada pelo péptido Aβ1-42, o que levou ao estudo de um possível envolvimento dos receptores P2 sinápticos. O bloqueio farmacológico dos receptores P2Y1 em neurónios de hipocampo de rato não só preveniu a morte neuronal causada pela presença de Aβ1-42, bem como a sinaptoxicidade que precede essa morte neuronal. Este efeito protector foi também observado in vivo. Em roedores, a administração intracerebroventricular de Aβ1-42 provocou uma diminuição na densidade de terminais nervosos no hipocampo e causou um déficit mnemónico, não tendo sido observado morte neuronal. Estes efeitos resultantes da administração de Aβ1-42 não foram observados em ratinhos aos quais foi removido geneticamente o receptor P2Y1. Para além disto, a administração de Aβ1-42 quer a ratos, quer a ratinhos levou a um aumento da densidade dos receptores P2Y1 localizados nas sinapses. Estes resultados demonstram que os receptores P2Y1 sinápticos estão envolvidos e são essenciais para a acção neurotóxica dos péptidos Aβ. Estes resultados indicam que os antagonistas dos receptores P2Y1 são potenciais candidatos para impedir a evolução da doença de Alzheimer, em particular numa fase inicial do desenvolvimento desta doença neurodegenerativa. Também é demonstrado que os receptores P2 pré-sinápticos interactuam funcionalmente com outros sistemas neuromoduladores, particularmente com o sistema neuromodulador operado pelos receptores nicotínicos para a acetilcolina (nACh). Quer a análise por imunocitoquímica, quer a monitorização microfluorimétrica de [Ca2+]i demonstraram que os receptores P2X e nACh estão simultaneamente presentes numa subpopulação de terminais nervosos de hipocampo de rato e estudos neuroquímicos permitiram definir farmacologicamente a existência de uma interacção funcional entre os receptores P2X e nACh no controlo da libertação de neurotransmissores. Esta conclusão é suportada essencialmente pela observação de um antagonismo cruzado entre os receptores P2X e nACh no controlo da libertação de glutamato de terminais nervosos de hipocampo de rato, envolvendo os receptores P2X1, P2X2/3, P2X3 e α3β2. Este papel promíscuo dos receptores P2 foi reforçado pela demonstração da existência de um receptor híbrido P2X2/NR2B no âmbito do estudo de uma possível interacção entre os receptores P2X e N-metil-D-aspartato (NMDA) para o glutamato. Contudo, este estudo estava inserido num objectivo mais vasto de testar a existência de receptores ionotrópicos híbridos compostos por subunidades de diferentes famílias de receptores. A subunidade NR2B tem um centro de ligação ao glutamato, mas não é capaz por si só de formar um canal. Todavia, em células HEK293, a co-expressão de P2X2 recupera a função NR2B. Para além disto foi observado que os transientes de [Ca2+]i induzidos pela aplicação de NMDA em células às quais se induziu a co-expressão das subunidades P2X2 e NR2B são insensíveis a Mg2+, são independentes de glicina e são prevenidos na presença de PPADS e D-AP5, antagonistas selectivos dos receptores P2 e NMDA, respectivamente. Estudos de co-imunoprecipitação demonstraram ainda a existência de uma associação física entre P2X2 e NR2B, quer em células HEK293 transfectadas, quer em cérebro de ratinho. Estes resultados demonstram pela primeira vez a existência de receptores P2X2/NR2B híbridos compostos por subunidades de diferentes famílias de receptores, o que constitui um novo conceito de receptor. Resumindo, esta tese apresenta evidências experimentais que indicam que os receptores P2 para o ATP têm essencialmente um papel neuromodulador ao nível pré-sináptico no cérebro, em particular no hipocampo. O ATP modula de um modo bifásico a libertação de neurotransmissores através da activação dos receptores P2Y e P2X. Estes receptores P2X são proteínas promíscuas que interactuam e controlam outros receptores ionotrópicos tais como receptores nACh e NMDA. Embora sejam necessários mais estudos para uma melhor compreensão do papel fisiológico dos receptores P2, também foi observado que o bloqueio dos receptores P2Y1 preveniu o dano neuronal e a perda de memória em modelos da doença de Alzheimer. Estes resultados demonstram um papel patofisiológico do ATP, indicando os antagonistas dos receptores P2Y1 como potenciais candidatos para impedir a evolução da doença de Alzheimer.
Description: Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Molecular) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia de Coimbra
Rights: openAccess
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