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dc.contributor.advisorSimões, Sérgio-
dc.contributor.advisorArnaut, Luís G.-
dc.contributor.authorRocha, Luís Gabriel Borges-
dc.date.accessioned2015-10-29T15:25:49Z-
dc.date.available2015-10-29T15:25:49Z-
dc.date.issued2016-05-11-
dc.identifier.citationROCHA, Luís Gabriel Borges - Development of a novel photosensitizer for photodynamic therapy of cancer. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/29825-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10316/29825-
dc.descriptionTese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra-
dc.description.abstractPhotodynamic Therapy (PDT) for cancer treatment is a safe and clinically-approved procedure that experienced great progresses over the last two decades. It is based on the interaction between a photosensitizer (PS) molecule, light and oxygen that react to generate reactive oxygen species (ROS). These ROS trigger a cascade of reactions that lead to the destruction of tumour cells and tumour vasculature. In comparison with the traditional oncological therapies, PDT has the advantages of a good tolerability profile, the absence of specific resistance mechanisms, a good cosmetic outcome and the ability to stimulate the immune system. This later aspect is regarded as a major therapy-differentiating factor. However, the widespread use of PDT is yet to be reached since the systemic photosensitizers currently on the market have been overshadowed by their limited efficacy and prolonged skin photosensitivity. Thus, there is a significant room for improvement, especially in the area of new PS molecules. Better PS molecules should be rationally designed to match, as close as possible, the properties that define the profile of the ideal PS. This work describes the nonclinical development of a new fluorinated sulfonamide bacteriochlorin, redaporfin, with very promising properties for anticancer PDT: simple and affordable synthesis, high purity and stability, molar absorptivity of 140000 M–1cm–1 at 743 nm, high quantum yields of ROS formation, photostability, solubility in biocompatible formulations, low toxicity in the dark and high phototoxicity. Direct comparison between PS based on literature data is often hindered because different experimental conditions are employed. To overcome this gap the in vitro performance of redaporfin was assessed against the two systemic PS for PDT of cancer on the market, Photofrin® and Foscan®, using the same experimental conditions. The comparison focused on the photosensitizing efficiency of the PS, the ratio between the dark toxicity and the phototoxicity, in two cancer cell lines. The results demonstrate that the in vitro performance of redaporfin is clearly superior to both competitors. Prior to the in vivo evaluation of redaporfin, three intravenous (iv) formulations were designed and optimized in mice with subcutaneous tumour, to determine its correspondent biodistribution and pharmacokinetic profiles. The most promising formulation was able to optimize the balance between a selective accumulation of redaporfin in the tumour, between 24 and 72 hours after administration, and a high bioavailability immediately after the injection. This versatility was exploited either in protocols that aim for a selective action, with longer drug-light-interval (DLI), and in protocols that aim for the vascular effect, with shorter DLI. In vivo studies confirmed the efficacy of redaporfin-PDT in the treatment of mice bearing subcutaneous tumours. We were able to cure mice using protocols with DLI of 72 h and 15 min. In addition, this redaporfin formulation was not associated with significant skin photosensitivity reactions in rats exposed to a solar simulator 7 days after the administration, which represent substantial reduction in skin photosensitivity in comparison to the systemic PS commercially available. The preliminary nonclinical safety evaluation of the redaporfin formulation revealed no signs of significant or long-term toxic reactions. The formulation was very well tolerated in mice and rats up to 100 and 20 mg/kg, respectively. The toxicity was assessed in rats and the results showed that, only after PDT, significant increases were observed on some serum biochemistry markers and on the circulating neutrophils population. Nevertheless, all significant changes were transient and returned to baseline levels within 1 week after PDT. The following development stage was dedicated to the exhaustive optimization of the treatment parameters in a mouse tumour model, leading to a vascular-PDT protocol 100% safe and with an overall long-term cure rate of 86%. This protocol was applied to treat the same tumours in immunosuppressed mice and completely fail to produce long-term cures, which suggests that the high antitumour efficacy of the treatment depends on the existence of a functional immune system. To further understand the role of the immune system on the treatment outcome, the ability of redaporfin vascular-PDT to induce antitumor immune memory was evaluated. The results showed that 67% of the mice, cured with the optimized PDT protocol for more than three months, completely rejected a second inoculation of the same tumour cells. In the control group the development of all reinoculated tumours was observed. This is a strong indication that this PDT protocol is able to induce an effective long-term antitumor immune memory. In addition, the systemic effect of redaporfin vascular-PDT was tested in a pseudo-metastatic mouse model. The results showed a significant decrease in the number of lung metastasis after PDT, in comparison with the non-treated control, demonstrating that this protocol is capable of producing a systemic effect against non-treated tumours. Globally, these studies produced strong evidences of the decisive contribution of the host immune system to the outcome of redaporfin vascular-PDT. In summary, redaporfin proved to be an extremely safe and highly effective PS for vascular-PDT. We hope that the promising results here presented can be successfully translated to the clinic, representing a significant contribution to improve the well-being of cancer patients.por
dc.description.abstractA Terapia Fotodinâmica (PDT) para o tratamento do cancro é um procedimento seguro e aprovado clinicamente que foi alvo de grandes progressos nas últimas duas décadas. Baseia-se na interacção entre um fotossensibilizador (PS), luz e oxigénio, que reagem gerando espécies reactivas de oxigénio (ROS). Estas desencadeiam uma cascata de reacções que conduzem à destruição das células e vasculatura tumoral. Em comparação com as terapias oncológicas tradicionais, a PDT tem como vantagens o bom perfil de tolerabilidade, a ausência de mecanismos de resistência específicos, o bom efeito cosmético e a capacidade de estimular o sistema imunitário. Este último aspecto é visto como um grande factor de diferenciação. No entanto, a aplicação generalizada da PDT ainda está por alcançar, uma vez que os fotossensibilizadores para administração sistémica actualmente no mercado têm sido ensombrados pela sua eficácia limitada e fotossensibilidade cutânea prolongada. Assim, existe uma margem significativa para melhoria da PDT, nomeadamente na área das novas moléculas fotossensibilizadoras. Melhores PS devem ser idealizados de forma a corresponder, tão bem como possível, às propriedades que definem o perfil do PS ideal. Este trabalho descreve o desenvolvimento não-clínico de uma nova bacterioclorina sulfonamida fluorada, redaporfin, com propriedades muito promissoras para PDT do cancro: síntese simples e de baixo custo, elevada pureza e estabilidade, absortividade molar de 140000 M–1cm–1 a 743 nm, elevados rendimentos quânticos de formação de ROS, fotoestabilidade, solubilidade em formulações biocompatíveis, baixa toxicidade no escuro e elevada fototoxicidade. A comparação directa entre PS com base em dados da literatura é frequentemente dificultada pela utilização de diferentes condições experimentais. Para ultrapassar esta lacuna a performance in vitro da redaporfin foi comparada com a dos PS sistémicos no mercado para PDT do cancro, Photofrin® e Foscan®, nas mesmas condições experimentais. A comparação focou-se na eficiência fotossensibilizadora dos PS, razão entre a toxicidade no escuro e a fototoxicidade, em duas linhas celulares tumorais. Os resultados demonstraram que a performance in vitro da redaporfin é claramente superior à dos dois competidores. Antes da avaliação in vivo da redaporfin, três formulações intravenosas (iv) foram idealizadas e optimizadas em murganhos com tumor subcutâneo, para determinar os correspondentes perfis de biodistribuição e de farmacocinética. A formulação mais promissora foi capaz de optimizar o equilíbrio entre a acumulação selectiva de redaporfin no tumor, 24 a 72 horas após a administração, e uma elevada biodisponibilidade logo após a injecção. Esta versatilidade foi explorada em protocolos que visam uma acção selectiva, com intervalo fármaco-luz (DLI) longos, e em protocolos que pretendem um efeito vascular, com DLI curtos. Estudos in vivo confirmaram a eficácia da PDT com redaporfin no tratamento de murganhos com tumor subcutâneo. Foi possível curar animais usando protocolos com DLI de 72 h e 15 min. Adicionalmente, esta formulação de redaporfin não originou reacções de fotossensibilidade cutânea significativas em ratos, expostos a um simulador solar 7 dias após a administração, o que representa uma redução substancial da fotossensibilidade cutânea em comparação com os PS sistémicos disponíveis comercialmente. A avaliação não-clínica preliminar da segurança da formulação de redaporfin não revelou sinais de toxicidade significativa ou de longo prazo. Esta foi muito bem tolerada em murganhos e ratos para doses de redaporfin até 100 e 20 mg/kg, respectivamente. A toxicidade foi avaliada em ratos e os resultados mostraram que apenas após a PDT se observaram aumentos significativos em alguns marcadores bioquímicos séricos e na população de neutrófilos circulantes. Apesar disso, todas as alterações foram transitórias, tendo regressado aos valores basais uma semana após a PDT. A fase seguinte de desenvolvimento foi dedicada à optimização exaustiva dos parâmetros de tratamento num modelo tumoral de murganho, tendo conduzido a um protocolo de PDT vascular 100% seguro e com uma taxa de cura a longo prazo de 86%. Este protocolo foi aplicado para tratar os mesmos tumores em murganhos imunodeprimidos, sem conseguir obter nenhuma cura a longo prazo, o que sugere que a elevada eficácia anti-tumoral do tratamento está dependente da existência de um sistema imunitário funcional. Para aprofundar o papel do sistema imunitário no resultado final da terapia foi avaliada a capacidade da PDT vascular com redaporfin induzir memória imunitária. Os resultados mostraram que 67% dos murganhos, curados há mais de três meses com o protocolo de PDT optimizado, rejeitaram totalmente uma segunda inoculação das mesmas células tumorais. No grupo controlo verificou-se o desenvolvimento de todos os tumores reinoculados. Isto constitui um forte indício de que este protocolo de PDT é capaz de induzir memória imunitária anti-tumoral efectiva e de longo prazo. Adicionalmente, o efeito sistémico da PDT vascular com redaporfin foi testado num modelo pseudo-metastático de murganho. Os resultados traduziram-se numa diminuição significativa do número de metástases pulmonares após a PDT, comparativamente ao grupo controlo não tratado, o que demonstra que este protocolo é capaz de produzir um efeito sistémico em tumores não tratados. Globalmente, estes estudos geraram evidências sólidas da contribuição decisiva do sistema imunitário para o resultado final da PDT vascular com redaporfin. Em suma, a redaporfin provou ser um PS para PDT vascular extremamente seguro e altamente eficaz. Esperamos que os resultados promissores aqui apresentados possam ser aplicados com sucesso na clínica, contribuindo de forma significativa para melhorar o bem-estar dos doentes com cancro.por
dc.description.sponsorshipBluepharma – Indústria Farmacêutica, SA and Luzitin, SA-
dc.language.isoengpor
dc.rightsopen accesspor
dc.subjectcancerpor
dc.subjectphotodynamic therapypor
dc.subjectphotosensitizerpor
dc.subjectbacteriochlorinpor
dc.subjectredaporfinpor
dc.subjectanticancer drugpor
dc.subjectdrug developmentpor
dc.subjectpharmaceutical formulationpor
dc.subjectsafety toxicologypor
dc.subjectantitumour efficacypor
dc.subjectmetastasispor
dc.subjectimmunotherapypor
dc.titleDevelopment of a novel photosensitizer for photodynamic therapy of cancerpor
dc.title.alternativeDesenvolvimento de um novo fotossensibilizador para Terapia Fotodinâmica do cancropor
dc.typedoctoralThesispor
Appears in Collections:FFUC- Teses de Doutoramento

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